DB46_T220-2012槟榔苗黄化病植原体PCR检测技术规范.DOCVIP

ICS 65.020 B 16 备案号：33827-2012 DB 46 海 南 省 地 方 标 准 DB 46/ T 220—2012 槟榔苗黄化病植原体 PCR 检测技术规范 Technical specification for PCR detection of arecanut yellow leaf phytoplasma of seedling 2012 - 04 - 18 发布 2012 - 05 - 18 实施 海 南 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布  DB46/ T 220—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由海南省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。 本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。 本标准首次发布于2012年4月。 I  DB46/ T 220—2012 槟榔苗黄化病植原体 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了槟榔苗黄化病植原体的检测技术规范。 本标准适用于槟榔苗中槟榔黄化病植原体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 Ct 值 指荧光信号有统计意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数。 3.2 槟榔苗 用成熟种果育成的实生苗，育苗时间在两年以内的苗。 4 原理 以染色体DNA为基础的分子生物学技术已用来检测和鉴定植原体。根据16S rRNA基因保守序列设 计通用引物，应用巢式PCR（nested - PCR）技术检测。根据16S rRNA基因序列设计翠菊黄化组（16SrⅠ 组）植原体特异性引物/探针组合，进行实时荧光PCR的检测。 5 仪器设备 台式高速冷冻离心机（最高转速在12000 rpm以上）、全自动数码凝胶图像分析系统、PCR仪、 全自动荧光定量PCR系统、全自动灭菌器、电子分析天平（万分之一）、旋涡混合器、水平电泳装置， 微量可调移液器（0.1-1000 μL)。 6 试剂和缓冲液配制 1  DB46/ T 220—2012 用于巢式PCR和实时荧光PCR检测的试剂和缓冲液配制，参见附录A。 7 检测方法 7.1 槟榔心叶总 DNA 提取 称取抽样的槟榔植株刚抽出的心叶0.5 g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1 mL DNA提取缓冲液 充分研磨，然后加入80 μL 10%十二烷基肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1~2 h，4℃ 6000 rpm 离心10 min， 取上清液；加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻轻混匀，-20℃保持至少30 min，4℃ 8000 rpm离心15 min， 弃上清；加入600 μL TE缓冲液、30 μL 10%十二烷基硫酸钠和12 μL蛋白酶K（5mg/ml），轻轻彻底悬 浮沉淀，37℃温育30-60 min；加100 μL 5M NaCl混匀，再加入84 μL CTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10 min；加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）混匀，4℃ 6000 rpm 离心5 min，重复直至无中间白色层；取 上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，4℃ 6000 rpm离心5 min；取上清液， 加入2/3体积异丙醇，混匀，-20℃保持至少30 min，4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清液；加入500 μL 70% 乙醇洗涤，4℃ 12000 rpm离心10 min，洗涤两次；取沉淀，加入50 μL TE混匀溶解。加入5 μL RNaseA(10 μg/μl)，37℃ 30 min, 除去RNA。 7.2 巢式 PCR 检测 下述反应均需同时设植原体16S rDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对 照，设灭菌双蒸水作为空白对照。 7.2.1 引物序列 引物采用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列见表1。 表1 巢式 PCR 检测的引物序列 引物名称 引物序列 5’-3’ R16mF2 CATGCAAGTCGAACGGA R16mR1 CTTAACCCCAATCAT