DB46_T280-2014罗非鱼链球菌病检测技术规程.DOCVIP

ICS 65. 150 B50 DB 46 海 南 省 地 方 标 准 DB 46/ T 280—2014 罗非鱼链球菌病检测技术规程 The detection technical regulations for Streptococcosis in Tilapia 2014 - 02 - 13 发布 2014 - 03 - 01 实施 海 南 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布  DB46/ T 280—2014 前 言 本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由海南省海洋与渔业厅提出并归口。 本标准起草单位：海南省海洋与渔业科学院、中国水产科学研究院珠江水产研究所。 本标准主要起草人：王德强、可小丽、刘志刚、佟延南、李芳远、卢迈新、高风英、朱华平。 I  DB46/ T 280—2014 罗非鱼链球菌病检测技术规程 1 范围 本标准规定了罗非鱼链球菌病病原体与流行情况、检测链球菌所用试剂、染色液和培养基、仪器设 备、采样、临床诊断、实验室诊断、细菌致病性实验和结果判定等方法。 本标准适用于罗非鱼链球菌病的检测与诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 病原体与流行情况 3.1 主要病原体 无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、海豚链球菌（Streptococcus iniae）。 3.2 流行情况 在我国南方罗非鱼养殖区，一年四季均有发生，水温30℃以上为爆发高峰期，对各种规格罗非鱼均 可造成危害。 4 试剂、染色液和培养基 除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。实验中所需常规试剂、染色 液和培养基均按SC/T 7201.1 和附录A的规定执行，其他分子生物学试验试剂按附录B的规定执行。 5 仪器设备 除下列仪器设备外，其余仪器设备按SC/T 7201.1 的规定执行。 a) PCR 扩增仪。 b) 核酸电泳仪和水平电泳槽。 c) 凝胶成像仪。 d) 微量移液器。 6 采样 1  DB46/ T 280—2014 病鱼样品采集按SC/T 7014的规定执行。 7 临床诊断 7.1 活动情况 患病鱼活动缓慢，反应迟钝，食欲减退，离群独游；病情严重时，常在水面翻滚或打转。 7.2 外部检查 体色发黑，眼球肿大突出，眼角膜发白浑浊，虹膜充血，严重者眼球脱落；下颌、鳃盖边缘、鳍条 基部不同程度的充血、出血，伴有肛门红肿、外突的现象；部分急性患病个体有时无上述症状。 7.3 解剖检查 肝脏充血、肿大，颜色不均，呈花肝状，质地脆弱；脾充血肿大；胆囊充盈、充满蓝黑色的胆汁； 部分患病鱼体出现腹水，肠道有轻度炎症，肠腔内有少量黄色的粘液。 8 实验室诊断 8.1 病原菌分离 8.1.1 平板划线分离 以无菌操作分别从病鱼眼、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织中取少量组织划线接种于血琼脂平板，28 ℃ 倒置培养24~48 h。 8.1.2 纯培养 用无菌接种环挑取单个菌落，接种于新的血琼脂平板上，28 ℃倒置培养24 h。 8.2 菌落形态 在血平板上培养24 h后，无乳链球菌菌落圆形，直径1 mm ~2 mm，呈乳白色、不透明，菌落表面湿 润光滑、微隆起、边缘整齐；海豚链球菌菌落圆形，直径1.5 mm ~3 mm, 呈灰白色、不透明，表面光滑、 湿润。 8.3 革兰氏染色 按GB/T 4789.28 执行。 无乳链球菌革兰氏染色呈阳性，菌体为球形或卵形，无鞭毛，无芽孢，菌体呈单个、成对或长链状 排列。海豚链球菌革兰氏染色呈阳性，球形，单个或成对排列，少数3 ~ 4个排成短链状，无鞭毛，无芽 孢。 8.4 生理生化检验 8.4.1 常规检测方法 运动性试验 2  DB46/ T 280—2014 用灭菌牙签或接种针将纯培养的细菌穿刺垂直接种于半固体BHI培养基中央，28 ℃培养24 h。通过 细菌由中央向周边迁移形成游动圈大小来检测其运动性强弱。 再用0.85