生物化学和原理1核酸-3.ppt

1 核酸的结构与功能 Southern印迹法 1、DNA样品制备过程中进程混入RNA，想通过A260/A280的数值来推算DNA的纯度。已知纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0，纯DNA的A260为1时的浓度为50ug/ml,纯RNA的A260为1时的浓度为40ug/ml。要确保DNA的纯度大于90％，试问A260/A280不得大于多少？ 2、列举可以鉴定出RNA样品中是否混入少量DNA的三种实验方法。 Polymerase chain reaction(PCR) 4、聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction (PCR) 4、Polymerase Chain Reaction (PCR) 反应体系： 模板核酸 引物 dNTP TaqDNA聚合酶 缓冲溶液 Mg2+ 反应程序： 变性温度 退火温度（Tm-25℃） 延伸温度和时间 循环次数 五、两性解离性质 核酸是两性电解质，（含碱性基团、磷酸基团），因磷酸的酸性强，常表现酸性。（核苷酸的解离性质 p142-143） 由于核酸分子在一定酸度的缓冲液中带有电荷，因此可利用电泳进行分离和研究其特性。最常用的是凝胶电泳（琼脂糖、聚丙烯酰胺）。 凝胶中加入溴乙锭（EB），分离的核酸条带在紫外光下发出荧光。 六、核酸的水解 1. 酸水解 RNA对烯酸不敏感。DNA嘌呤碱基所连接的C-N键在1mol/L的盐酸溶液中很容易被水解，释放出嘌呤碱，生成脱嘌呤酸。 2. 碱水解 DNA对碱稳定。 RNA对碱敏感。在稀碱溶液中很容易被水解，得到2’,3’-核苷酸混合物。 （1）化学裂解法：Maxam /Gilbert法 （2）链终止法：Sanger法 DNA测序 （1）Maxam-Gilbert method for DNA sequencing 将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P） 在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰，产生一系列长度不一而5端被标记的DNA片段 聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开,根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。 （2）DNA sequencing by the Sanger method （2）DNA sequencing by the Sanger method DNA sequencing by the Sanger method The chain termination or dideoxy method of DNA sequencing Strategy for automating DNA sequencing reactions 毛细管凝胶电泳 荧光 Isolation of eukaryotic mRNA via oligo(dT)-cellulose chromatography 有一个DNA双螺旋分子，其相对分子量为3×107，求（1）分子的长度？（2）分子含有多少螺旋？（3）分子的体积是多少？（脱氧核糖核酸碱基对的平均分子量为618）。 （1）分子长度 = （3×107/618）× 0.34 = 16505nm （2）分子含螺旋数 = 3×107/618×10=4854 或 16505/3.4 （3）分子体积 =πR2h =π×（1nm）2　×16505nm =51825.7nm3 计算 一段双链DNA包含1000个碱基，其组成中G+C占58%，那么在DNA的该区域中胸腺嘧啶残基有多少？ * * 1.1 核酸的种类、分布和化学组成 1.2 DNA的结构 1.3 RNA的结构 1.4 核酸的性质 1.4 核酸的性质 p169 一、核酸的溶解性质 二、核酸的紫外吸收特性 三、核酸的沉淀特性和浮力密度 四、DNA的变性与复性 五、两性解离性质 六、核酸的水解 一、核酸的溶解性质 微溶于水，不溶于有机溶剂（乙醇、氯仿） DNP(DNA-蛋白质)溶于高盐溶液(1mol·L-1NaCL) RNP溶于低盐溶液 二、核酸的紫外吸收特性 p170/141 在核酸分子中，一般在260nm左右有最大吸收峰 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系 核酸及其组份定性和定量测定的依据 蛋白质（酪氨酸和色氨酸）的最大吸收在280nm ◆DNA的紫外吸收特性的应用 1. DNA或RNA的定量 A260=1相当于 50μg/ml 双链DNA 40μg/ml RNA或单链DNA 20μg/ml 寡