ε-聚赖氨酸抑致病菌分子机理及对肠道菌群多样性影响的研究.pdf

摘要 摘要 ￡．聚赖氨酸(￡．PL)是天然存在的一类聚氨基酸，具有对细菌、酵母菌、霉 菌的广谱抗性，且安全无毒、水溶性好、热稳定性高。作为逐渐被推广使用的食 品防腐剂，其抗菌的分子机制尚未清晰阐明。 本论文通过微生物培养，原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM) 观察，抑制消减杂交文库筛选，实时定量PCR和基因敲除等技术，并根据不同 技术选取适合的研究对象，对￡-PL抑制典型致病菌(食源性、医源性)的现象和 分子机制进行了深入的研究。最后采用PCR．DGGE技术，评估了口服￡．PL对小 鼠肠道微生态菌群的影响。 论文分为六个章节。第一章对食品防腐剂，尤其是天然防腐剂的分布、性质、 特性进行了描述，重点对天然微生物抗菌剂￡．PL的理化性质、抗菌活性及机制， 应用范围和发展方向进行了系统的阐述。 01 在第二章中，以Bc办P，纪办砌∞Zf57：H7为模式微生物，系统探讨了￡．PL 对致病菌的抑菌活性和分子机制。结果发现￡．PL拮抗EcD如0157：H7的活性随 oC、25 5～ oC和37 温度的升高(4 oC)和处理时间的延长(0～15h)递增：在pH 7环境中抑菌活性没有显著变化，在pH大于8时活性降低。AFM和TEM观察 结果表明，￡．PL能破坏细胞膜的结构，形成膜穿孔，使胞质呈不均匀分布，细 胞内容物泄漏。￡．PL能诱导细菌内活性氧的产生，且其浓度随着￡．PL浓度的增 加而升高。R1、PCR检测结果表明，￡．PL能对细菌产生氧胁迫，损伤细菌DNA， cD，f 并抑制E 0157：H7的侵染毒力。 为进一步研究￡一PL的抑菌分子机理，探讨其对致病菌的基因调控影响，在 第三章中以常见感染且难以抑杀的条件致病菌．白色念珠菌(C彻旃出口舾加以s ATCC 14053)为研究对象，采用SSH技术对￡．PL抑菌前后的差异基因进行了筛 选。R■qPCR验证结果显示，在￡一PL亚致死浓度胁迫下，C口f6fc绷s有lO个发 生差异表达的基因，表明￡一PL能通过降低糖酵解和脂类代谢相关基因的表达， 抑制C．口f6纪口瑚的糖代谢并导致C口舾把口脚中脂类代谢的紊乱。蛋白质合成相 关基因GCNl、精氨酸tRNA合成酶及泛素蛋白连接酶Asi3的上调表达则表明， II 摘要 ￡．PL的抑菌活性能破坏细胞结构，并促进C口胁纪口”s蛋白的降解。 通过基因敲除造成基因缺失是进一步验证￡．PL抑菌分子机制的有效方法。 肠炎沙门氏菌是污染食品的主要食源性致病菌，其双组分信号转导系统以特定的 方式调控沙门氏菌的毒力，抵抗抗菌肽的抑菌作用。基于沙门氏菌的基因敲除系 统有方法成熟，且操作简单的优势，在第四章中，通过敲除SP门胞，．豇觚中抵抗 ￡．PL对SP刀把，豇舰野生株和基因敲除株的相关基因表达影响的差异，探讨其抑 制＆P船绝，．打砌s的分子机制。结果显示S P胛胞，豇砌s△p乃DP对￡一PL的敏感性显著 增加，且PhoP—PhoQ所调控的下游基因的表达显著下降，而＆P行纪r豇五d矗△rcsF 在￡．PL中的生长速率较之野生株没有显著差异，表明PhoP．PhoQ调控系统在 SP刀胞厂打砌s抵抗￡．PL的过程中起到关键性的作用，而RcsFCDB调控系统则不 能被￡一PL激活。 ￡．PL作为食品防腐剂，是否会对机体肠道微生态菌群平衡造成影响，未见报 道。在第五章中，采用PCR—DGGE和ImqPCR相结合的方法，分析了灌胃￡．PL 两周过程中小鼠粪便中菌群结构和数量的变化。结果显示，乳杆菌属菌群多样性 有所增加。乳杆菌属、拟杆菌属和肠杆菌属的菌体数量所占比例无显著性变化， 提示￡．PL不会影响小鼠肠道菌群的平衡，具有一定的食用安全性。 关键词：￡．聚赖氨酸；致病菌；抑菌分子机制；活性氧：基因敲除；肠道菌 群 III