荧光假单胞菌CP1108的发光酶基因(luxAB)标记及其应用.pdfVIP

摘 要  Pseudomonas sp.CP1108 为分离自棉花根圈的解磷假单胞菌，经过 16S rDNA序 列比对，鉴定为荧光假单胞。通过三亲本杂交的方法将标记基因  luxAB  接合转移进  CP1108菌株，所得的标记菌株 CP1108L 具有发光活性和对 Str、Tet 和 Km三种抗生 ­5  素的抗性，转移频率为(4.65±0.01)×10  。将标记菌株经连续进行 20 次传代，均可检 测到发光现象。采用碱裂解法从 CP1108L 中提取质粒，证明 pTR102质粒已成功地转 移到 CP1108菌株中，并且发现 CP1108L菌株的部分生理生化特性、生长曲线和在土 壤中的存活能力并没有受到 luxAB基因导入的影响。 研究标记菌株在土壤中的存活情况，结果发现，在 0~42d 内，标记菌株在灭菌土 壤和不灭菌土壤中均能存活，总体呈现下降趋势，在灭菌土壤中的定殖水平稍高于不 3  4  ­1  灭菌土壤， 第 42d 时， 标记菌株的定殖密度约为 10 ~10 cfu∙g  土。 将标记菌株 CP1108L  接种到棉花根盒的微宇宙土壤中，研究其定殖情况，发现标记菌株在棉花根表的定殖 密度高于根际土壤中的定殖密度，主要定殖在 0~6cm 根段，且随着深度的增加定殖 密度降低；棉花生长 14d时，CP1108L在棉花根圈达到了最高定殖水平，根圈的的定 5  ­1  5  ­1  殖数量为 2.31×10 cfu∙g  根土、3.18×10  cfu∙g  鲜根，而其中以 0~2cm根段处标记菌 4  ­1  5  ­1  株的定殖数量最大，根际和根表分别达到了 9.08×10 cfu∙g  根土、1.44×10  cfu∙g  鲜 根。 把棉花幼苗根部浸于细菌菌液中，研究了细菌在棉花幼根根表的吸附情况。发现 稳定吸附发生在细菌与棉花幼根接触的前 8min，在前 60min 内，细菌的吸附量随吸 附 时 间 的 延 长 而 增 大 ， 并 且 逐 渐 趋 于 饱 和 ， 解 磷 菌 的 最 大 吸 附 量 为  8  ­1  (1.02~1.48)×10 cell∙g  鲜根；从细菌的吸附动态 曲线可 以看出，其吸附规律符合  Langmuir 吸附等温线。经计算，E.coli DH5α、CP1108和 CP1108L在棉花根表的最大 6  ­1  8  ­1  8  ­1  吸附量 q 分别为 4.05×10  cell∙g  、1.45×10  cell∙g  和 1.19×10  cell∙g  。解磷细菌的最 0  8  ­1  6  ­1  大吸附量(10 cell∙g  )约是大肠杆菌的最大吸附量(10  cell∙g  )的 100倍，说明解磷促生 菌株对棉花幼根具有较高的亲和性。因此，可将解磷菌株制成微生物接种剂应用于棉 花的盆栽试验研究。 对棉花进行盆栽试验， 结果发现接种 CP1108 和 CP1108L菌液处理棉花植株的干 重、主根长和株高显著高于对照组  CK Ⅰ；两个菌株处理之间差异性不显著，说明  luxAB基因的导入对 CP1108L促生长能力并没有显著影响。  CP1108 菌株是从棉花根圈筛选出来的具有较强解磷能力的荧光假单胞菌，其标 记菌株 CP1108L 接种到棉花后，性状稳定，能在棉花根部吸附、定殖和存活，从而 促进棉花的生长，因此可以用 CP1108L代替 CP1108进行土壤微生态学研究。 关键词：荧光假单胞菌，luxAB 基因，三亲本杂交，棉花根圈，盆栽试验 I