拟穴青蟹(Scylla+paramamosain)Histone+2A的基因克隆、表达及其合成肽Sphistin的抗菌特性与抗菌机理研究.pdfVIP

摘要 摘要 拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我国南部沿海重要经济养殖品种，由 于缺乏拟穴青蟹的相关免疫知识，迄今无法真正实现拟穴青蟹的健康养殖。抗菌 肽类的免疫因子在海洋动物的先天性免疫中具有重要作用，因此挖掘新的抗菌肽 对揭示拟穴青蟹的免疫机制具有重要的科学意义。组蛋白Histone是真核生物染 色体的基本结构蛋白，一些研究证明组蛋白的成分具有抗菌活性。本实验室在前 期研究中，从LPS刺激的拟穴青蟹血细胞SSHeDNA文库中筛选到一个类似 Histone 2A的基因，推测其可能在拟穴青蟹体内具有抗菌等免疫功能，因而对其 进行了细致的研究工作，取得了以下研究成果。 1．阐明了拟穴青蟹Hi．one2A的cDNA全长序列。拟穴青蟹Histone2A eDNA序列(GeneBank登录号为FJ774663)全长1096 bp，包含一个384bp的 开放阅读框，编码128个氨基酸，其理论分子量为13463．6Da，等电点为10．58。 2．合成肽Histone 2A具有显著的抗菌活性，命名为Sphistin。利用生物信息 学分析了拟穴青蟹Histone2A基因序列和氨基酸序列特征，通过化学合成方法合 2A 成了拟穴青蟹HistoneN端前38个氨基酸。采用液体倍比稀释法测定了 Histone 2A合成肽对8种革兰氏阳性菌、13种革兰氏阴性菌、2种酵母菌的最小 抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示Histone2A合成肽对重 要的水产致病菌嗜水气单胞菌等7种革兰氏阴性菌、人畜致病菌金黄葡萄球菌、 表皮葡萄球菌等4种革兰氏阳性菌均有抑菌作用和杀菌作用，大部分MIC浓度 小于6州，对毕赤酵母菌同样有抑杀作用。结果表明Histone2A基因的合成肽 h MCl061和谷氨酸棒杆菌的杀菌动力学曲线研究表明，1．5“MSphistin可在2 杀灭90％以上的谷氨酸棒杆菌；3lxM 0min杀灭90％以上的金黄 Sphistin可在1 色葡萄球菌：25 h可以杀灭90％以上的大肠杆菌MCl061。 gMSphistin在3 人肝癌细胞HepG2检测Sphistin对细胞的毒性程度。将0-100I．tg／mLSphistin分 别与两种细胞共孵24h，在显微镜下观察细胞形态，并应用M1Yr法检测细胞相 对活力。结果表明0--100 pg／mL浓度范围内的Sphistin对鼠正常成骨细胞 摘要 均表现出抑制细胞活力的作用。将100 h gg／mLSphistin与HepG2细胞共孵24 后，细胞相对活力降低了20％。细胞形态观察和MTT检测细胞活性结果表明， Sphistin对正常细胞无明显细胞毒性，而对癌细胞有抑制作用。 造后在细菌内部表达荧光素酶，使用大肠杆菌MCl061检测Sphistin与细胞膜作 用的情况。大肠杆菌MCl061与高浓度(25 gM和50 rtM)的Sphistin作用后， 荧光发光量显著高于阴性对照蛋白组(六胜肽)，表明其迅速破坏了细菌的细胞 的作用后，荧光检测结果表明低浓度的Sphistin仅是抑制了细菌的繁殖却并未杀 是一种破坏细胞膜结构的蛋白，可以增强细菌细胞膜的通透性和破坏细菌细胞膜 的结构。 5．获得了拟穴青蟹Histone 和pBV220构建了三个Histone 载体在大肠杆菌中诱导表达了Histone