鸡Mx基因的克隆及其抗AIV活性的研究.pdf

摘要 Mx蛋白是干扰素诱导的动力蛋白样GTP酶，在生物界广泛存在，具有广谱的抗病毒作用。 编码Mx蛋白的基因最初是在野生型A2G小鼠中发现的，因能保护A2G小鼠耐受相对其它随机 氨基酸多态性与Mx蛋白抗病毒活性的关系时发现，当鸡Mx蛋白第631号氨基酸位点为天冬酰 胺时，该蛋白具有抗流感病毒和水疱性口炎病毒活性，当第631号氨基酸位点被丝氨酸取代时则 号氨基酸位点为天冬氨酸时并不能保护鸡抵抗H1N1型流感病毒感染。因此，本实验旨在研究鸡 Mx蛋白在该位点为不同氨基酸时是否会特异性地影响鸡的抗流感病毒能力，从而为提高鸡自身 抗病毒能力及应对禽类病毒的威胁提供新思路。 本研究首先从我国7个主要地方品种鸡的脾脏中提取总RNA作模板，通过RT-PCR法扩增出长 21 性，通过比对发现不同品种鸡Mx基因有17个碱基差异，12个发生错义突变，导致了氨基酸位点 确后对№灌因第1892号核苷酸位点进行定点突变，使两纯合子鸡Mx基因编码的氨基酸第631位实 现天冬酰胺与丝氨酸间的替换。重组表达质粒经菌液PCR、酶切鉴定及测序验证正确后，提取并 纯化重组质粒。经脂质体介导转染MDCK细胞，RT-PCR、Western blotting和流式细胞技术(FCM) 6IRNA、蛋白和细胞水平证明^叙基因的表达。结果显示：对鸡瞄因进行定点突变修饰成功， 且己成功构建能正确表达鸡Mx蛋白的真核重组质粒。 RealTime 结果显示：两个纯合子鸡突变前与突变后的Mx基因在重组质粒转染细胞中均能抑制AIV增殖， 但各质粒间差异不显著，在细胞水平上未发现鸡Mx蛋白第631位氨基酸多态性对AIV的抗性差 异。 关键词：Mx基因，基因克隆，定点突变，禽流感病毒 Abstract GTPasesfoundinall are vertebrate imefferon(IFN)-induceddynamin-like species №【proteins examinedSO exhibita ofantiviral Mxl oftheinbredA2G far,andthey range capabilities．Theprotein strainofmiceconfersresistancetOdosesofinfluenzavirusthata聆lethaltootherstrains．In 2002，Ko et revealedthatanaminoacidvariationofAsnat 631 was to antiviral a1．study position specificpositive was toconferantiviral toinfluenzavirusandvesicularstomatitis whichdemonstrated MX responses was tO eta1．found theother ofSer hand，that Mx．Unexpectedly，Bendield virus；On specificnegative influenzavirus thattheAsn631 hadno on