MMP-7基因的克隆表达及其在癌症检测中的价值评估.pdf

摘要 摘 要 背景：近年来国内外的多项研究报道人基质金属蛋白酶-7 （Matrix metalloproteinase-7 ， MMP-7 ）在多种类型癌症及肿瘤细胞系中存在过表达现象，而在相应的正常组织中却不 表达或低表达，这预示其较高的诊断价值。在血清学中也有部分报道，但对癌症患者血 清中自身抗体的检测还未见报道。我们检测了食管癌，胃癌，乳腺癌，肺癌血清中MMP-7 自身抗体的存在情况，以初步评估其诊断价值。并利用原核表达系统表达该蛋白，制备 该蛋白的多克隆抗体，为后续研究打下基础。 方法：提取食管癌组织中总RNA ，根据 GeneBank 公开发表的 MMP-7 cDNA 序列设计 引物，用 PCR 方法扩增开放阅读框架内 492bp 的DNA 片段，并将该片段定向插入到原 核表达载体 pET-17b 和 pET-28b 中，获得了两种重组表达质粒。将PCR 、酶切鉴定及测 序鉴定正确的重组质粒，转化入大肠杆菌 E.coli Rosseta (DE3) 中，经IPTG 诱导蛋白表 达，SDS检测所表达的蛋白，对重组蛋白的表达条件进行优化，并对表达重组蛋 白进行可溶性分析。在变性条件下利用Ni-NTA 凝胶亲和层析纯化重组蛋白。纯化的重 组蛋白一部分用于制备小鼠多抗，另一部分直接包被酶标板，利用间接 ELISA 的方法 对 50 例食管癌病人,38 例胃癌病人，43 例乳腺癌病人，及 48 例肺癌病人血清中 MMP-7 自身抗体进行检测，进而对检测方法的诊断价值进行评估。 结果：获得 492 bp MMP-7 编码序列的 DNA 片段，并成功构建两种原核表达载体 pET-17b-MMP-7 和 pET-28b-MMP-7 ，构建了 MMP-7 重组蛋白的表达系统 pET-28b- MMP-7/Rosseta (DE3) 。SDS显示该重组表达菌能高效表达出 18kDa 左右的融合 蛋白，分子质量大小与预期一致。通过改变 IPTG 的浓度，温度和诱导时间，确定了表 达基因的最佳诱导条件：IPTG 终浓度为 0.4 mmo1/L，诱导时间为 4h ，诱导温度为 37 ℃。经可溶性分析，目的蛋白以包涵体的形式存在。在变性条件下用Ni-NTA 凝胶亲和 层析法获得了高纯度的融合蛋白。免疫小鼠获得特异性较高的多克隆抗体。血清中 MMP-7 自身抗体在食管癌病人、胃癌病人和乳腺癌病人中的含量与正常组比较差异显 著（P0.01 ）, 而在肺癌中与正常组相比无显著差异（P ＞0.05 ）。 结论：MMP-7 融合基因可在大肠杆菌中获得高效表达，MMP-7 自身抗体可作为诊断食 管癌、胃癌及乳腺癌较为理想的标志物。 I 摘要 关键词 MMP-7 基因 原核表达 蛋白纯化 自身抗体 II Abstract Abstract Background: The previous investigations have shown that Matrix metalloproteinase-7 ， (MMP-7) is abundantly expressed in a broad range of malignant neoplasms and transformed cell lines, and has not been detected in normal or adjacent nonaffected tissue, so MMP-7 is to be a possible biomarker .There is also a part reports in serological, but for serum antibodies detec