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Myostatin基因沉默转基因羊的培育探索 摘要 Mvostatin(肌肉生长抑制素)基因是肌肉生长发育的负调控因子， 该基因的突变或缺失的牛肌肉发达，实验室获得的该基因沉默的转基因 鼠和斑马鱼肌肉发达程度均显著增强。Myostatin基因在肌肉发育中的作 用已被广泛认可，因此Myostatin基因在动物新品种的培育方面具有巨大 潜力。羊是重要的经济动物，提高羊的生长速度及瘦肉率具有重要经济 价值。本研究欲培育出Myostatin基因沉默的转基因羊，同时联合利用慢 病毒技术、RNA干扰技术、流式细胞分选等技术建立一种快速建立转基 因阳性细胞系的方法，为建立转基因动物模型提供参考。本研究主要研 究内容及结果如下： 1．IⅢA干扰片段的筛选。根据RNA干扰片段设计原理设计4条干扰片 4．1．CMV 段并连接到pSilencerneo载体上。利用脂质体将干扰载体转染 进成纤维细胞内，48 因的相对表达量，筛选出一条沉默率90％的RNA干扰片段。 2．慢病毒包装。将获得的高效RNA干扰片段连接至慢病毒穿梭质粒，构 建GSSl穿梭质粒，将慢病毒穿梭质粒、包装质粒、包膜质粒共转染293T 细胞，48、72h收集细胞上清液，经离心获得病毒颗粒，利用稀释法检 tIl／mI，。 测慢病毒滴度，滴度约1×108 3．Myostatin基因沉默成纤维细胞系的建立。将获得的高滴度慢病毒感染 成纤维细胞，72h荧光显微镜下观察感染效率，在传第3代时进行流式 细胞术分选，转基因阳性细胞率为94．5％，为提高阳性率，在第6代时再 次进行分选，获得的转基因阳性率为99．O％。经半定量PCR鉴定，转基 因阳性细胞Myos协in基因沉默率约为90％。 4．核移植及胚胎移植。卵母细胞体外成熟22h后，将转基因阳性细胞注 入去核的卵母细胞中，融合及激活后，体外培养发育，约20％的重构胚 发育至囊胚，30％的胚胎带有绿色荧光。胚胎移植11只供体羊，4只怀 孕。 关键词：RNA干扰慢病毒转基因核移植绵羊 II oFBREEDINGTRANSGENIC RESEARCH THE SILENCING WITHMYoSTATINGENE SHEEP ABSTACT isa roleinmuscle and regulator gro嘶h Myostatillgene negatiVe inme thatmutations haVedemonStrated myostatingene development．Studies inmusclemassin leadtodramatica11d increases multiplespecies， widespread and asa suchaS mousezebrafish．MyostatinnegatiVe cattle，tr{msgen an roleina11imal is ofmuscle