ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性的研究.pdf

摘要 摘要 神经生长因子(nerve factor，NGF)是神经系统最重要的生物活性分 growth 子之一，其生理作用十分广泛，尤其在促进神经元的生长、发育、分化与成熟、 维持神经元的存活与损伤修复及再生等方面发挥着重要作用，它还参与免疫反 应，并具有促进伤口愈合和血细胞生长，抑制肿瘤生长等作用。 NGF在人体组织中含量极微，已有报导从胎盘中纯化hNGF，但其组织来源 极其有限，成本高产量低，不能满足科研和临床的需要，所以利用基因工程方 法获得大量有生物学活性的NGF蛋白，对其基础理论研究和临床应用具有深远 的意义。 目前，国内已有研究者尝试在不同的表达系统中进行重组表达，但是在表 达产物中很难获得活性较高的二聚体形式的蛋白。由于目前发现的绝大部分的 以含前导肽的前体形式合成的蛋白质，其前导肽都有帮助其正确折叠的作用， 所以本研究对含前导肽的人NGF基因(proNGF)在大肠杆菌中进行了表达，并以 此来探讨NGF前导肽在辅助成熟肽的折叠及二硫键的配对过程中的作用。本论 文的主要研究工作和结果如下： 序列和试验需要设计出特异的引物，在目的蛋白基因的上游引入编码肠激酶识 别序列的碱基和NdeI酶切位点，用PCR的方法扩增出含前导肽的人NGF基因 鉴定。 2．把克隆的proNGF基因插入大肠杆菌表达载体pETl5b中，构建重组表 BL21(DE3)pLysS· 3．用Immol／L 声破碎后离心，上清和沉淀分别进行SDS．PAGE电泳检测，目的蛋白以包涵体 的形式存在，融合蛋白分子量大小约为30．2kDa，表达量占全菌总蛋白量的 19．2％。 摘要 的多克隆抗体发生特异性结合反应，在30kDa处出现单一的条带，表明诱导表 达的重组proNGF具有免疫学活性。 5．通过镍柱亲合层析纯化和肠激酶切割得到了proNGF蛋白，分子量为 13．1mgproNGF蛋白。 6．将纯化后的proNGF在氧化还原环境下进行透析复性，RP．HPLC法对 复性结果进行检测，通过与标样保留时间的对比确定了已复性的成份， 7．对影响复性的环境因子进行初步的研究，RP．HPLC外标法对复性结果 进行定量分析，计算出不同条件下的复性率。 突触样生长，表明透析复性后的proNGF具有良好的生物学活性。 关键词：神经生长因子 前导肽 包涵体 蛋白折叠PCI2细胞 n Abstract Abstract factoris most Nerve oneoftheimportantfactors、Ⅳi也biologicalactivity, growth survival all rolein the ofthe regulatinggrowth,development,and playingimportant neuronbutalsotothe andtherehabilitationofthescathednervecells．It regeneration Call thebalanceofthe and keep systemsofneural，endocrineimmunity． in aboutthe TheleveloftheNGFhumanis low．Fromthe