应用基因芯片技术筛选胆道闭锁致病基因和验证分析.pdfVIP

肝组织为对照组，3例BA患者肝组织为实验组。这两组样本用于基因芯片技术对 两者间差异性表达基因的检测。 2、经术前超声、MRCP、术中所见、术中胆道造影证实为BA患者15例，术 存；无肝胆系统畸形的同年龄段尸检患儿5例，取肝组织，离体后．80℃冰箱保存。 其中5例尸检肝组织为对照组，15例BA患者肝组织为实验组，两组样本用于后 期芯片的验证分析。 二、全基因组表达谱基因芯片技术及Real．timePCR技术 1、应用全基因组表达谱芯片检测BA肝脏组织和胆汁淤积型肝炎患儿肝脏组 织的基因表达谱，筛选两者差异表达基因，并进行基因网络关系分析、分子标志 物筛选等。 2、从基因芯片结果中选择与肝胆发育相关的致病基因ARF6(芯片结果中 高)，应用Real．timePCR方法从基因水平检测BA肝脏与尸检肝脏中两者的相对 含量，与芯片结果进行比较。 三、数据分析 1、基因芯片的数据分析 (1)原始数据的标准化、低强度基因的过滤：通过NimbleScanv2．5软件芯片 系统，应用Robust MultichipAverage(简称：RMA)方法对原始数据进行分析， 过滤低强度基因(选择基因强度_100．0做进一步分析)。 (2)过滤后的基因数据质量评价：包含盒子图分析和散点图分析。 (3)差异表达基因的筛选：通过火山图展现有统计学意义的差异表达基因(标 准是差异倍数芝2．0和P值0．05)。 (4)热点图和层次聚类图：用于过滤后基因的层次聚类分析。 (5)路径分析方法：差异表达基因的路径分析。 (6)GO分析：差异表达基因的显著功能分析。 2 2、统计分析 1 采用SPSS 7．0软件进行统计分析。计量数据以X4-s表示，数值比较采用，检验 分析，PO．05为差异有统计学意义。 结 果 1、BA与胆汁淤积型肝炎患儿肝组织相比，涉及生物学过程的差异基因存在 3666条，这些差异基因的功能主要涉及器官组织发育、免疫炎症反应、细胞基质 代谢，细胞代谢的调控，细胞间信号转导调控，细胞凋亡等，而这些功能与细胞 炎症及组织重构有密切关系。其中与肝胆系统发育相关的差异基因22个，其中上 调基因16个，下调基因6个。 2、所筛查的与肝胆发育相关的差异基因，下调基因有：AACS、AHRR、 6■勿6，IGSF4，PCSK9，LSRo 3、应用Real．timePCR对基因ARF6、AACS进行定量检测，实验组的表达量 与对照组比较分别上调3．8388，下调2．73161与基因芯片检测结果(实验组相比 近。 结论 1、胆道闭锁的发病与细胞炎症及组织重构有密切关系。 程中可能起到重要作用。 3、基因芯片技术是一种快速、高通量的研究生物信息的分子生物学技术，与 Real．time PCR分析基因表达的差异均可信。筛选出的与肝胆发育相关的差异基因 AACS、ARF6可能参与胆道闭锁的发病过程，为研究胆道闭锁的发病机制提供新 的思路。 3 关键词 胆道闭锁 基因芯片 肝胆系统Real．timePCR 4 ·英文论著摘要· ofthe for Atresia CandidateGenes Screening Biliary Gene andValidation by chip analysis ectives