影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究.pdf.pdfVIP

第 3卷 第 1期 热 带 生 物 学 报 JoURNALOFTROPICALORGANISMS Vo1．3No．1 2012年3月 Mor．2012 文章编号：1674—7054(2012)01—0022—05 影响根癌农杆菌 EHA105感受态细胞 转化效率因素的研究 高世武，郭晋隆，阙友雄，许莉萍，杨颖颖，陈如凯 (福建农林大学 农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点开放实验室，福建 福州350002) 摘 要：通过对EHA105菌株48h不间断培养观察 ，绘制出其生长曲线图；同时用不同浓度的CaCI，溶液分 别制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞 ，在转化过程中用不同的温度进行热激处理，统计分析阳性转化 子个数，明确了采用冻融法将外源 DNA导人农杆菌 EHA105时的几个影 响因素 的参数。结果表明，当 DD 值在 1．0—1．5之间时，根癌农杆菌EHA105正处在对数生长期 ，活力最强；制备感受态细胞时，CaC1 溶液的浓度在6～10mmo]·L 之间，无显著差异，但以10mmol·L 效果最佳，转化率达 5．322X10。· g～，热激处理温度在 20～37℃之间均无显著差异，但 37℃处理时转化率最高，达5．550×10。·Ixg一。 关键词：根癌农杆菌EHA105；生长曲线；冻融法 ；转化率 中图分类号：Q78 文献标志码：A 自从 1985年HORSCH等 ¨发明了农杆菌介导的烟草叶盘转化法以来，农杆菌介导的基因转化技术 得到了快速发展。通过农杆菌介导获得转基因植物的报道也越来越多，如水稻、玉米、小麦、棉花、西红柿 等 。根癌农杆菌(Agrobactriumtumefaciens)是 1种革兰氏阴性土壤杆菌，含有 1种环形的Ti质粒 ( 200kb)，该质粒含有 1段 T．DNA和 基因，当其侵染植物细胞后，能将其T．DNA插入到被侵染细胞的基 因组中，并能稳定遗传给后代 ，可作为外源 DNA进人植物细胞的载体 。但在农杆菌介导的基因转化过 程 中，将携带外源基因载体质粒导人农杆菌是第 1个限速步骤 。目前将重组质粒导人农杆菌的方法有多 种，但都存在着一些弊端。例如，三亲杂交法，其操作繁琐，转化过程长达2d，并且需要辅助质粒 ；电激 转化法需要昂贵的仪器和耗材，转化条件严格_9；相比之下，冻融法虽然转化效率低 ¨，但 由于其操作简 单，不需昂贵的仪器和耗材，因此，在普通实验室中得到了广泛的应用。 影响冻融法转化效率的主要因素有农杆菌的生长状态、感受态细胞的质量、转化时的热激温度 等¨卜HJ，由于培养基及农杆菌菌株不同等原因，各文献报道 的优化条件有所不同。为此，本试验 以根癌 农杆菌EHA105为受体细胞，并用多梯度不同浓度的CaC1处理，使其处于感受态，然后使用本实验室 自 己构建的p2AST2301植物表达载体质粒DNA进行转化，分析根癌农杆菌EHA105的生长状态、不同浓度 CaC1所制备感受态细胞的质量以及转化时的热激温度对根癌农杆菌 EHA105转化效率的影响，筛选出 具有较高转化效率的优化条件，旨在为根癌农杆菌EHA105介导的基因转化试验提供参考依据。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 菌株及质粒 根癌农杆菌(Agrobactriumtumefaciens)菌株EHA105由农业部甘蔗遗传改 良重点开 收稿 日期 ：2011—12—01 基金项 目：国家 自然科学基金项 目；国家高技术研究发展 “863”计划863项 目(2007AA100701)；福 建省科技厅国家科技项 目(F2007AA100701)；现代农业产业技术体系建设专项资金项 目(nyeytx一 024—01—06) 作者简介：高世武 (1982一)，男，河南南阳人，福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点开放实验 室助理研究员。硕士． 通信作者：陈如凯．E．mail：fafu948@126．com 第 1期 高世武