p53在日本脑病毒复制及其致病性中的作用.pdf

摘要 virus，JEV)是一种经蚊虫传播，能引起人中枢神经系统损 日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis 伤的黄病毒。目前控制日本脑炎病毒的主要手段是疫苗预防和蚊虫清除，但是全球每年仍有近50 000的病例和近30％的死亡率。因此，仍需要开发有效的抗病毒策略来弥补疫苗控制的不足。了 解病毒与宿主细胞的相互作用，有利于寻找有效的抗病毒策略。p53具有抗肿瘤、DNA修复、促 细胞凋亡和抗病毒等功能，许多病毒在感染过程中都与p53相互关联，但至今尚未见到JEV与 p53相互作用的报道。为了探讨p53在JEV感染中的作用，我们开展了如下研究： 和PIEC细胞，用间接免疫荧光(IFA)和westernblot方法检测细胞内p53的细胞定位和蛋白水平。 blot IFA结果显示在感染细胞内，p53核聚集明显减少，并且这种减少是一种普遍现象；western 胞核进行分离，Western blot结果显示细胞质和胞核内的p53均减少。通过p53荧光素酶活性分析， JEV感染后细胞内p53活性显著下降(庐O．05)；Westernblot结果显示p53靶基因IRF9的表达明显 减少。另外，IFA结果显示，在JEV感染细胞内NS3与p53存在细胞共定位现象；免疫共沉淀试 平和活性，并证实NS3蛋白与p53相互结合，提示NS3可能参与了对p53功能的影响。 blot和定量PCR分析，发现转染 细胞内p53进行基因沉默，然后观察JEV的复制。通过western 150rim siRNA48h后能有效的将p53基因沉默，并通过细胞活率测定和流式细胞分析，证实转染 p53siRNA在短期内不影响细胞的生长特性及细胞周期。将JEV感染p53基因沉默的A549细胞， 胞中NS3mRNA水平显著高于对照组(∥O．01)；Western blot结果表明，p53基因沉默细胞中NS3、 E蛋白的表达明显高于对照组；空斑试验数据显示，’53基因沉默细胞产生的病毒粒子明显多于 对照组(10～100倍)。上述结果说明，在细胞模型中p53能有效抑制JEV的复制。 感染p53基因沉默的A549细胞，分析细胞凋亡的情况。通过台盼蓝排斥试验，发现JEV感染p53 基因沉默细胞后，引起更多细胞的发生死亡po．05)；通过原位末端转移酶标记试验(TUNEL)和 流式细胞术(Annexin V-PI)分析细胞凋亡情况发现，JEV感染p53基因沉默细胞诱导更多细胞发生 述结果说明JEV诱导的细胞凋亡不依赖p53，反而由于p53的缺失，促进了陀V诱导的细胞凋亡． 4、p53抑制JEV对小鼠的致病性。为了观察p53在JEV致病性中的作用，通过皮下注射将 通过定量PCR测定外周血中NS3mRNA水平，结果显示JEV在感染后第3天病毒血症达到峰值， 组织中NS3抗原阳性的细胞数要明显多于p53WT小鼠。上述结果说明在小鼠体内p53也能抑制 JEV的复制。病理切片的结果显示，p53KO小鼠脑组织中(大脑皮层和海马)的胶质细胞分泌更多 小鼠∞O．05)。上述结果说明，JEV感染p53KO小鼠引起更严重的炎症反应。 为了观察JEV感染后小鼠的免疫反应，本研究通过流式细胞分析了外周血和脾脏中I)C，M饥 血中，IX；和Mq)比例显著上升，而p53WT小鼠的比例没有显著变化。上述结果说明，p53影响 T细胞的比例却没有 感染小鼠脾脏中，p53WT的CD4T细胞显著增殖，但是p53KO小鼠的CD4 T细胞的增殖，参与机体的免疫反应。 变化。该结果提示p53可能通过调节CD4 5、小鼠脑组织全基因表达谱差异分析。为了探索p53抑制JEV复制及其致病性的机制，筛 选潜在受p53调控的并参与JEV感染的基因，我们对小鼠脑组织进行了全基因表达谱分析。通过 子(趋化因子、白细胞介素和肿瘤坏死因子等)的表达上调，而一些与细胞先天性免疫相关分子表 达下调，一