pcr检测沙门菌方法的优化.pdf

摘 要 就全球范围而言，沙门氏菌是引起细菌性食物中毒最常见的致病菌。传统的沙 门氏菌检测技术通常需时4--7天，且操作繁琐，难以应对食物中毒的快速诊断以及 食品企业和管理部门对食品安全的实时监控，这就对研究沙门氏菌快速检测技术提 出了要求。目前沙门氏茵快速检测技术多采用免疫学技术、核酸分子杂交以及聚合酶 Chain 链式反应(PolymeraseReaction，简称PC鼬等技术。在沙门氏菌检测技术中， PCR技术相对于其他传统技术，具有快速、简便、敏感性高和特异性强等特点，被广 泛用来检测沙门氏菌。目前，关于检测沙门氏菌的PCR技术较多，但是从快速性、 敏感性和特异性等方面来说，都没有达到最大程度的优化。本研究从对增菌方案、DNA 模板的制各、引物的选择、PCR反应体系、避免假阴性等方面进行对检测沙门氏菌的 PCR技术进行优化，试图建立一种最佳的检测沙门氏菌的PCR技术。实验结果如下： 1．使用BPW(缓冲蛋白胨水)增菌液为培养沙门氏菌的增菌液，37℃增菌，不振荡 的要求，过多的延长增菌时间是没有必要的；在增菌培养的前8h，使用选择性培养 基和振荡培养并不能提高增菌效果。这样就建立了快速简便的样品增菌方案。 2．从快捷、简便和经济角度考虑，热裂解法是最佳的模板DNA制备技术。 别达到99．4％和100％，相对于其他常用的引物检测效果较好。 4．经多次实验摸索，反应条件是模板在97℃变性7min，以保证PCR的顺利进行；复 性和延伸温度为60℃Imin：用29个循环：建议用1．0U酶扩增即可出现亮带，另外， 注意不同来源和批次Taq酶效果不完全相同；dNTPs的终浓度定为100tunol·L．1；引 物的终浓度为0．32 tanol·L～。 control，IAC) 5．在PCR反应体系放置指示假阴性的扩增内标(internal amplification 是必要的。本研究通过添加一条人工构建的IAC片段来防止假阴性的出现，从而提高 PCR检测的准确率。 关键词：沙门氏菌；PCR检测；优化 ofPCR．BasedMetIlodforDetection Optimization ofSalmonella hbstract remainsa c勰offoodbomeillnessinhumansworldwide． 勋加onella major Traditionalmethodsfor and Salmonellatake isolating identifying of detectionforSalmonellaenableofficial and Developmentrapid assays agencies in foodindustriest0 contaminatedfoodstuffsandother a man∞f identify samplestimely More numberofalternafivemethodsfordftfetionofSalmonellahavebeen recently，a including acid and chain developedimmunoassays，nucleichybridizationpolymerase the for