ⅰ型鸭肝炎病毒p1、vpo和vp3基因的真核表达.pdfVIP

摘 要 摘 要 Ⅰ型鸭病毒性肝炎是由Ⅰ型鸭肝炎病毒引起的雏鸭高度致死性传染病。在我国爆发的 鸭肝炎主要由DHV- Ⅰ引起，给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。但是有关DHV- Ⅰ病毒 蛋白功能的研究报道较少，其中大部分还只是对其基因组结构和蛋白组成的预测，并且还 有分歧。由于分子生物学相关研究进展非常缓慢，使得对该病的诊断和防治比较落后，本 实验通过对DHV- ⅠQV 株结构蛋白的VP1 、VP0 和VP3 基因克隆、真核表达和免疫活性 检测的研究，为DHV- Ⅰ的诊断、分子流行病学研究和新型疫苗的研制提供科学依据。 本实验根据GenBank 上已发表的DHV- Ⅰ基因序列设计了三对特异性引物，以QV 株 为模板，采用RT-PCR 方法扩增了 QV 株VP1 、VP0 和VP3 编码基因，将其分别克隆到 pFastBacHTB 载体上，然后转化大肠杆菌Top10 感受态细胞，经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴 定及 PCR 鉴定，筛选出阳性重组质粒并送测序；随后将阳性的重组质粒分别转化到 DH10Bac 感受态细胞中，通过蓝白斑筛选和PCR 鉴定，获得阳性重组转座子。在脂质体 介导下将获得的重组转座子分别转染 sf9 昆虫细胞，获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒 感染的细胞收集，超声波裂解后，进行SDS和Western-blot 免疫学活性分析。 实验表明，成功地克隆了DHV- Ⅰ（QV 株）结构蛋白VP1 、VP0 和VP3 基因。构建 了重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-VP1 、rBacmid-VP0 和rBacmid-VP3 。转染sf9 细胞后， SDS和Western-blot 分析表明，成功的表达了VP1 、VP0 和VP3 蛋白，大小分别为 36 KD，38 KD 和30 KD 左右。三种蛋白均能与DHV- Ⅰ全病毒免疫阳性血清发生特异性 免疫反应，说明所表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。这为以真核表达的VP1 、VP0 和VP3 蛋白为抗原的基因工程疫苗的研制奠定了基础。 关键词：DHV- Ⅰ；真核表达；VP1 、VP0 和VP3 基因 I Abstract Eukaryotic Expression of vp1 、vp0 and vp3 Gene of Duck Hepatitis Virus Type Ⅰ Abstract Duck virus hepatitis (DVH) caused by duck hepatitis virus type Ⅰ(DHV- Ⅰ) is a highly mortal infection disease. DHV- Ⅰis prevalent in China, which lead large economic loss for duckery. To date, no much research of protein function for DHV- Ⅰhas been reported, only the genomic structure and proteidic organization predicted, which greatly hindered the relevant research. In this study, structural protein VP1,VP0 and VP3 gene of DHV- ⅠQV strain was cloned and were expressed in eukaryotic expression system, which is important for the research of molecular epidemiology of DHV- Ⅰand new type vaccines for DHV- Ⅰ. In this study, three pairs