ⅰ类新城疫病毒p和p基因分子流行病学研究及ndv08-004株反向遗传操作系统的建立.pdfVIP

反向遗传操作系统的建立 摘要 NP和P蛋白基因进行分子流行病学分析，基本掌握了我国目前I类新城疫 病毒的分子特征。通过构建I类新城疫病毒代表株NDV08．004全长感染性 cDNA克隆，并成功拯救出重组病毒，为I类新城疫病毒的致病机理和相关 蛋白的功能研究奠定了基础。 1．I类新城疫病毒NP基因分子特征的研究 了分子特征和遗传进化关系分析，结果表明所有I类新城疫病毒分离株完整 通过多序列比对，发现I类NDV在NP蛋白基因上的特征性位点，如：D460E ， 分析表明60株I类NDV分离株可分为两个不同的亚型，两个亚型之间NP 蛋白氨基酸差异在2．7％～4．1％之间，核苷酸差异在4．6％～7．9％之间。 2 I类新城疫病毒P基因分子特征的研究 通过对60株I类Ⅻ)V分离株P基因的扩增和分子遗传进化关系分析， 编码399个氨基酸。通过多序列比对，发现I类NDV在P蛋白基因上的特 ⅫDV均在P基因的编码区插入12nt。同源性分析结果显示，I类毒株与Ⅱ 类毒株P蛋白的氨基酸同源性在64．5％～72．8％之间，核苷酸同源性在 亚型，两个亚型之间P蛋白氨基酸的差异在5．7％～9．7％之间，核苷酸差异 在5．5％～7．8％之间。 3．I类新城疫病毒拯救体系的建立 3．1 全长cDNA克隆以及辅助质粒pCI-L的构建 通过设计7对特异性引物，将NDV08—004的基因组分为的7个不同的 片段分别克隆至pGEM—Teasy载体，然后利用相应的单酶切位点将7个片段 病毒的“分子标签’’。采用同样的单酶切位点构建了表达L蛋白基因的辅助 质粒pCI二L。 3．2 NDV08一004的拯救 T7／5细胞，通过将转染细胞及 NDV08．004．po按照一定比例共转染BSR 其上清接种SPF鸡胚，结果成功拯救出了具有血凝性的n奶V08．004，初 代血凝价为2lo醇，传代后血凝价达到7lo醇以上。通过对分子标签的测 序验证证明了病毒的拯救。NDV08。004株的成功拯救为开展I类新城疫病 毒的致病机制及新型疫苗的研究奠定了基础。 Ⅱ 关键词：新城疫病毒I类NP基因P基因全长c研蛆克隆病毒拯 救 III MOLECULAREPIDEⅦOLOGYOFCLASSI八旧WCASTLE DISEASEⅥRUSANDESTABLISH崛卜盯OFREⅦRSE GENETICSSYSTEMOFNDV08．004STRAIN AB STRACT Themn NPandP of60Cl淞sINDV in length gene isolates，obtained ChiIla t0201 alld duriI玛2008O，were锄plified in先ctiouscDNAcloneofNDV08．004s旬隐inw嬲als0 cons仃uctedaIldme recomin舭tVims舳V08一004wasrescued a success舢y．1hisprovide foulldmationfor on and VaccinesofclassI conducting删ypathogenesis NDVs． 1 Molecular CharaCterizationofNP of60Cl嬲sIND