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张明明：I群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建一 ! I群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究 及重组禽腺病毒的构建 中文摘要 腺病毒最早发现于1953年，由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒。腺病毒 毒是禽类常见的病毒之一，大部分在禽体内复制却不致病，少数引起轻微的病症。对禽腺 病毒的流行和变异国外有很多研究工作，国内的报道较少。 腺病毒作为载体，宿主范围广，致病性低，在机体内复制不发生整合，安全性高；能 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，病毒滴度高；腺病毒载体应用 方便，载体疫苗可经口服途径接种。因此以腺病毒作为病毒载体具有独特的优势。许多学 者在禽类腺病毒载体方面做了很多研究工作，国内研究较晚，但是所研制的基因工程疫苗 离临床应用还有一定距离。目前，对禽腺病毒载体研究主要使用CMV启动子，获得了较 好的表达效果，也有使用病毒自身的晚期启动子／先导序列(MLP／LS)的报道，但是尚未见到 对两个启动子的重组病毒的免疫效果进行比较的报道。 本研究从外表健康禽群中随机采取泄殖腔拭子，根据禽腺病毒CELOV的全序列设计 进行了比较。结果表明：本次分离的9株禽腺病毒与血清l型的代表株CELoV和我们实 发表的CELOV的全基因组序列设计了引物，对分离株的保守序列Ol强8进行了扩增和序 均具有高度同源性，符合腺病毒的基因组结构特征。根据以上序列分析结果，本研究证明 扬州大学博士论文 了这些分离到的禽腺病毒属于I群禽腺病毒。同时，禽腺病毒在鸡群、鸭群、鹅群中非常 普遍，有必要对这些病毒的生物学特性进行研究。 为了更好的了解分离株的生物学特性以便探讨其作为活病毒疫苗载体的可能性，通过 病毒凝集实验、电镜形态观察、细胞病变、动物攻毒实验等方法对上述疑为I群禽腺病毒 3个分离株进行了研究。电镜观察病毒粒子，结果发现病毒为球型、无囊膜，直径为70．80衄， 具有腺病毒典型的二十面体结构。红细胞凝集试验证明，分离到的病毒均不能凝集鸡的红 细胞，与I群禽腺病毒的特征一致。细胞培养表明：病毒分离株不能引起鸡胚成纤维细胞 细胞变圆，折光性增强等病变。鸡胚接种试验未见明显肉眼可见的病变，鸡胚生长发育正 常，这与I群禽腺病毒分离株CELOV的特性不完全一致。 通过大剂量皮下注射和口服两种途径接种1日龄的SPF鸡，进行人工致病性试验。结 果发现，试验鸡在感染病毒后，未出现任何明显临床症状。在10日龄时，皮下注射和口 服攻毒的小鸡的体重都明显轻于对照组，而在20、30日龄时，各组和健康对照组之间体 重没有明显差异，表明该分离株对SPF鸡的体重影响不大，呈一过性。在10日龄时，攻 毒组小鸡主要免疫器官重量略低于对照组，实验后期各组免疫免疫器官的重量基本一致。 组织病理学切片观察结果表明，部分脏器有轻微病变，大部分脏器基本没有病变，后期组 织器官均正常。这表明该病毒对免疫器官没有明显的生长抑制和可见的病理损伤。以上体 内外实验均表明病毒分离株致病性低，生物安全性高，可能是较好的禽腺病毒载体。 前期研究中筛选了FAv二JS的复制非必需区，将CMV调控外源基因表达的表达盒插入 验室分离的所有禽腺病毒中选择ⅣⅣ．JS进行重组禽腺病毒的构建。本研究根据CELOV全 基因序列设计引物，从Ⅳ胴-JS基因组中PCR扩增出腺病毒的主要晚期启动子(MLP)， 启动子替换为MLP启动子，而其它部分不变，从而构建了MLP启动子控制的通用转移载 体pFAMLP 张明明：I群禽腺病毒的分离鉴定和生物学特性研究及重组禽腺病毒的构建 堡 正向转移载体pF舢儿P-eGFP，以用于重组病毒的构建。 离株感染的原代鸡胚肾细胞(CEK)，进行细胞内同源重组。转染后的细胞及细胞上清混合 物经过冻融和离心处理，取上清进行稀释，感染96孔细胞培养板上的CEK单层，结果连 续传了三代后，仍然能观察到绿色荧光蛋白的表达，表明成功构建了表达eGFP的重组禽 腺病毒，为探讨晚期启动子在重组病毒中是否可以高效的表达外源蛋白，重组禽腺病毒基 因工程疫苗的启动子对疫苗免疫效果的影响提供了条件。 关键词：禽腺病毒；分离鉴定；生物学特性；重组病毒；晚期启动子 扬州大学博士论文