ⅰ群禽腺病毒核检测方法及dna疫苗的研究.pdf

I群禽腺病毒核酸检测方法及DNA疫苗 的研究 摘 要 I群禽腺病毒属于禽腺病毒科禽腺病毒属主要包括12个血清型，各血 清型毒株之间含有相同的群特异性抗原，鸡胚致死孤儿病毒、鸡包涵体肝 炎病毒等为I群禽腺病毒中较为常见的毒株。不同日龄的家禽和野生鸟类 均可感染I群禽腺病毒，引起典型的临床症状如：包涵体肝炎、贫血和生 产能力下降，给养禽业带来极大危害。【l】。 利用两对引物分别对I群禽腺病毒的12个血清型毒株的heXon基因的 对所扩增片段的序列和限制性酶切位点分析，选择限制性内切酶HacII对扩 增产物进行酶切片段多态性分析。结果，本研究所扩增的I群禽腺病毒的 12个血清型毒株的目的片段，其酶切片段呈现多态性。表明该限制性内切 酶能对I群禽腺病毒的12个血清型进行分型。 根据I群禽腺病毒hexoIl基因保守区序列，设计一套特异性LAMP引物， 建立了一种适用于I群禽腺病毒的LAMP快速检测方法。结果表明该方法可 以特异的扩增出I群禽腺病毒的12个血清型标准毒株，对构建的I群禽腺 病毒质粒DNA最小检测限可达1×101拷贝／止；L蝴P方法对I临床样品的检出 Green 率高于PCR方法；在扩增产物中添加SYBRI染料后可通过肉眼观察有 无荧光产生而对结果进行直接判定。本研究建立的LAMP方法简便、快速、 灵敏、特异性高，可作为I群禽腺病毒感染的快速诊断方法。 PCR，和LAMP四种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和临床疑似样品进 行检测，比较四种核酸检测方法的敏感度。并与与传统的病毒分离方法进 行对比。结果四种核酸检测方法中Real—tiIllePCR最为敏感，可以检测到 只能检测到1×103拷贝／此。结合临床疑似病料检出结果表明在实践中根据实 际情况需要选择合适的检测法对I群禽腺病毒(丸W)进行检测是十分必 要的。 融合基因重组真核表达载体。并将该重组质粒转染Vero细胞，通过lmPCR、 免疫荧光试验对重组质粒的体外瞬时表达情况进行检测鉴定。检测结果显 细胞中获得表达。 hexon组，灭活苗对照组，空载体对照组，及空白对照组。免疫后每周采血 一次，ELISA方法检测抗体水平。于第5周进行攻毒实验，并于攻毒后的3 天，5天，7天，14天采集各组鸡的肛门绵拭子，检测排毒情况。结果显示 能更好的抑制排毒。 为了研究免疫DNA疫苗以后其在体内的动态分布情况、在各组织的出 胸肌多点注射，每只鸡200pg，接种后的不同时间分别对鸡的心，肝脏，脾 脏，肺，肾脏，胸腺，法氏囊，肠，接种部位肌肉以及血液采用Real-time．PCR 和半巢式PCR方法进行检测。结果在接种DNA疫苗1～3小时以后血液中可以 II 检测到DNA疫苗陆续出现。14d以后各组织器官的DNA疫苗开始陆续消失， 肌肉接种部位105d时仍然可以检出DNA疫苗。本研究为DNA疫苗的临床应 用提供理论及数据支持。 关键词：I群禽腺病毒hexon基因核酸检测DNA疫苗体内分布 免疫保护 THESTUDYOFAAV NUCLEICACⅡ)DETECTl0NANDDNA VACC斟E ABSTRACT FowladenoViruses theAdenovifidaeandtheAviadenovimscan belor培to deVidei11t0 are12 ofaViImadenovirusesill tbree印ups，thereserotypes I． 罂．oup T1wo of were to Aand pail．s primersdesi罂ledampli匆the of