口蹄疫病毒vp基因转染树突状细胞对t淋巴细胞的活化作用研究.pdf

摘 要 口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（FMD virus, FMDV ）引 起偶蹄动物多发的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。严重危害家畜 的生产力和畜产品质量，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失，直接威胁着 国际贸易和国家声誉及人类食品卫生，因而受到人们的普遍关注。目前，针对预防 口蹄疫疾病的爆发和流行，多数发展中国家主要采用注射灭活病毒疫苗的方法。但 灭活疫苗存在灭活不彻底和保护期短等缺点。因此，新型口蹄疫疫苗及免疫策略的 研究已成为亟待解决的焦点问题。口蹄疫病毒衣壳由4 种结构蛋白 VP1,VP2,VP3,VP4 各60 个拷贝组成，VP1 蛋白又称1D 蛋白，其基因位于基因组的 2977-3615 ，编码213 个氨基酸。早期研究表明，结构蛋白VP1 暴露在病毒颗粒的 表面，是诱导产生中和抗体的主要成分。 本实验以质粒pMD18-VP1 为模板，经过EcoRI 和HindIII 双酶切鉴定和基因序 列测定得到FMDV 的VP1 基因，对目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)分别以 相同的限制性酶EcoRI 和HindIII 消化后，经T4 连接酶连接构建重组质粒,转化宿 主菌大肠杆菌 DH5α 后得到重组质粒，经酶切鉴定正确后，对重组质粒 pcDNA3.1-VP1 进行测序，结果表明，VP1 基因定向克隆到表达载体pcDNA3.1 中。 将 VP1 基因与 GenBank 发表的序列进行同源性比较，证明本研究所用毒株与 Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO 基因编码序列(NCBI 登陆号分别为 AY333431.1) 同源性最高，可达100%。结果证明pcDNA3.1-VP1 重组质粒构建成功。 为鉴定 pcDNA3.1-VP1 基因能否在真核细胞中表达，本研究用重组质粒 pcDNA3.1-VP1 转染小鼠的单核细胞源树突状细胞(MoDC) ，同时用空载体转染 MoDC 作为阴性对照。Western blot 检测结果显示，在分子量约为60kD 处有一条明 显的蛋白条带，而空载体在相应位置未见蛋白条带。为了验证转染 VP1 的 MoDC 能否有效地激活淋巴结T 细胞，本研究用转染VP1 的MoDC 和淋巴结T 细胞组成 共培养体系，以负载了灭活FMDV 抗原的MoDC （FMDV+DC ）与淋巴结T 细胞作 为阳性对照，以单纯的MoDC 为阴性对照，用ELISA 法检测不同时间点IFN-γ 水 平变化。结果显示，转染VP1 的MoDC 与负载了灭活FMDV 的MoDC 一样，均可 + 有效地激活淋巴结T 细胞，但转染VP1 基因的MoDC 可能激活的是淋巴结CD8 T 细胞，并能诱导其释放大量的IFN-γ。这些试验结果为进一步研究DC 提呈FMDV 抗原机制和新型疫苗的开发奠定了重要基础。 关键词：口蹄疫病毒；VP1 基因；真核表达；细胞转染；树突状细胞 T lymphocyte Activation Triggered by Dendritic Cells Transfected with FMDV VP1 Gene Author : Li Jie Supervisor: Professor Wang Jia-xin Major: Preventative Veterinary Science Abstract Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious viral disease of cloven-hoofed animals,including cattles, pigs an