日本血吸虫体被膜蛋白分析及表膜蛋白sjnpp-5的初步研究.pdf

摘要 起的一种严重危害人畜健康的寄生虫病。在日本血吸虫完成其生活史的过程中，尾蚴侵入宿主后 脱去其单层外质膜形成具有双层外质膜的体被被膜。作为日本血吸虫和宿主相互作用的主要界 面，伴随着其表膜蛋白不断合成和降解，体被被膜不停地更新，不同发育阶段虫体体被结构发生 了明显的改变，从而使日本血吸虫能适应寄生生活，在宿主体内完成其生活史。本研究利用蛋白 质组学shotgun技术系统分离、分析不同发育时期日本血吸虫体被表膜蛋白，为探索血吸虫的免 疫逃避机制及其与宿主的相互作用关系，进而为筛选疫苗候选分子、诊断抗原和药物靶标提供基 础。同时，对日本血吸虫一体被表膜蛋白磷酸二酯酶-5(SjNPP-5)编码基因进行了克隆、表达及 初步的免疫保护效果评估，为深入开展该基因的生物学功能研究创造了条件。 1．日本血吸虫体被表膜蛋白分离与初步分析 本研究收集了感染新西兰白兔的8d、ll d．雌虫以及42 合抱期成虫、42 d．雄虫共12个时期的日本血吸虫虫体，应用非渗透性生物素 进一步分离，再使用串联质谱对各期虫体体被表膜蛋白进行分析鉴定。初步结果分别从8d、IId、 14d、17d、20d、23d、26d、29d、32d、42d-合抱期成虫、42d．雌虫以及42d．雄虫虫体中分 202个和331个体被表膜蛋白。初步分析表明在已被鉴定、生物学功能明确的体被表膜蛋白中， 有不少是血吸虫的重要功能分子，在血吸虫营养摄取、信号传导及逃避宿主免疫应答中具有重要 作用，如23KD膜蛋白、四跨膜蛋白(TsP)、29KD膜蛋白、膜磷脂结合蛋白(Anncxin)等膜 及IgG和IgM抗体重链，C3补体分子等与宿主同源的蛋白。对这些蛋白的深入分析、鉴定工作 仍在进行。 本研究对多个不同发育阶段的日本血吸虫虫体的体被表膜蛋白进行系统地分离、分析，研究 成果对分离、鉴定与日本血吸虫营养摄取、免疫逃避、信号传导等相关的重要功能分子，探讨血 吸虫的生长发育机制及血吸虫与宿主的相互作用关系，进而对疫苗候选分子、诊断抗原和药物靶 标的筛选都具有重要意义。 2．日本血吸虫体被表膜蛋白磷酸二酯酶-5(SjNPP-S)的研究 在不同发育时期日本血吸虫体被表膜蛋白质谱分析的基础上，挑选出一体被表膜蛋白磷酸二 族(NPPs)的一个成员，该家族为具有相同保守结构的外膜蛋白，都具有水解膜外核苷酸、磷脂、 胆碱磷酸酯的焦磷酸酯键／磷酸二酯键而释放5t．核苷单磷酸的活性，该活性被称为NPP活性． 该蛋白是在日本血吸虫多个发育时期虫体体被不断更新过程中出现的，在血吸虫寄生生活中可能 起着重要作用． 本研究利用PCR扩增获得SjNPP-5的全长cDNA序列，其ORF为1371 bp，编码456个氨基 酸，理论分子量为52245．13 kDa。Real-time 粒，在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，分子量为69 RT-PCR分析表明该基因在 21 lO倍。Western 疫荧光实验结果显示SjNPP．5主要表达于日本血吸虫各个时期的虫体被膜上．用纯化的 重组蛋白特异性IgG抗体迅速产生，且一直维持在一个较高的水平。免疫保护机制研究表明，应 用重组抗原三次免疫后，免疫鼠血清中特异性的IgGl和IgG2a抗体水平都持续升高，但 能在日本血吸虫的生长发育过程中起着重要作用。 综上，针对体被表膜蛋白在血吸虫生长发育中具有重要作用，本研究对日本血吸虫不同发育 时期童虫和成虫的体被表膜蛋白进行系统地分离和分析，发现了一批具有重要生物学功能的血吸 虫体被表膜蛋白分子。对日本血吸虫体被表膜蛋白SjNPP-5编码基因进行了克隆、表达及对其在 小鼠体内诱导的免疫保护效果进行评估。本文对深入探讨日本血吸虫的生长发育机制及血吸虫与 宿主相互作用关系，筛选血吸虫疫苗候选分子、诊断抗原和药物靶标提供了重要基础。 关键词：日本血吸虫，体被表膜蛋白，Shotgun，生物信息学分析，sjN：PP-5 Ⅱ Abstract infection诵tlISchisto