禽传染性支气管病毒m基因在毕赤酵母中表达与蛋白活性检测.pdfVIP

摘 要 禽传染性支气管炎(AvianInfectiom 0BY)引起的鸡的一种急性、高度接触性的传染病。IBV的变异大，血清型多，是m 免疫预防的一大难题。mVM蛋白比较保守，在病毒粒子中所占的比例最大，同时具 有膜蛋白的典型特点，是重要的免疫原基因。M蛋白的这些特性为M蛋白作为IB 的诊断抗原提供了重要的分子生物学及免疫学依据。 本研究根据本课题组在GenBank中注册的禽传染性支气管炎病毒中国分离株 序列设计引物，通过鸡胚培养收获禽传染性支气管炎病毒，提取病毒RNA，用RT-PCR 方法扩增出IBV M基因，构建了克隆载体pMDl8．M，通过菌落PCR和酶切对克隆 DNA连接酶将两者连接后转 酶EcoRI和NotI进行双酶切，回收目的片段，用T4 化大肠杆菌，筛选得到酵母表达载体，经酶切鉴定M基因已经正确地连接到pPIC9K 毕赤酵母GSIl5中。将在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定、表型筛选和不同 His+Vim+。将重组菌株在1％的甲醇中进行诱导分泌表达，通过收集不同时间段的表 达产物进行SDS．PAGE分析表明，在诱导72小时后目的蛋白表达量最大，表达蛋白 占上清中总蛋白量的13．3％，表达蛋白的分子量约为33KD。 白进行初步纯化后，以M蛋白为包被抗原的ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性 抗体反应良好，表明表达的M蛋白生物学活性良好。目前国内外还没有利用毕赤酵 M蛋白的报道。本研究表达的IBVM蛋白可 母分泌型表达载体pPIC9K来表达IBV 作为制备m诊断抗原的基础材料，对m的防治有重要理论和实用价值。 关键词：禽传染性支气管炎病毒M基因 毕赤酵母分泌表达 。本研究获得“十五”国家高技术研究发展计划(863计划)资助，课题编号：2003AA241120 andProtein ofAvainInfectious Expression ActivityAnalysis virusM inPichia Bronchitisgene pastoris LiaoJuan(ProventionMedicine) Veterinary Driected byProf．WangHongning ofAnimaland MedicineofSichuan Science University, (College Veterinary Agriculture Yaall,Sichuan,China,625014) Directed Prof．WangHongning by Abstract infectiouswhichhasbeen IBVisafastand disease variatingfrequently． highly--touched hasmuch andwas to M wasrathor It difficult serolcIgical prevent．IBV