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里氏木霉rutc30甘露聚糖酶基因man1在毕赤酵母中的高效表达
摘 要
甘露聚糖类物质是自然界中半纤维素的第二大组分，分布广泛。D一甘露聚糖酶能水解
底物生成甘露寡糖，释放出与之结合的水分、微量元素等。应用于猪、鸡、鸭和水产动物日
粮，可提高饲料的利用效率，减少养殖业环境污染。甘露寡糖具有改善动物胃肠道微生态环
境的功能。多种细菌、真菌、软体动物等分泌B一甘露聚糖酶，其基因属于糖基水解酶家族
5。B甘露聚糖酶在工农业生产和环境保护等方面有着厂泛的用途。因此本研究的主要目
的就是构建甘露聚糖酶的。J一程酵母来高效表达甘露聚糖酶，以解决目前甘露聚糖酶产量低、
成本高等问题，同时也为生产甘露寡糖提供有效的解决途径。
到毕赤酵母穿梭表达载体pPIc9K中，构建重组质粒pPIc9KwⅫl，经黝cI线性化酶切
5(His
PEO将其整合到毕赤酵母GsllMut+)染色体上，利_E；|jMM、MD平板筛选His+Mul8
型阳性克隆，在含不同浓度G4I
8一YPD平板筛选高拷贝转化子。共筛选28株附性克隆，将
筛选到1株高拷贝菌株进行5L发酵罐优化表达研究，经测定蛋白分泌量达1
5m∥mI，。表
达产物经sDs—PAGE电泳分析，重组目标蛋白质量分数达到总蚩白的90％以上：相对分子
质量为66KD，较理论设计值大，分析是因目标蛋白发生糖基化所致。该重组转化子RMAN23
遗传稳定性良好。甘露聚糖酶活性测定结果为250Iu加L(刺槐豆胶为底物)和470Iu／n1L
4
(魔学为底物)。通过酶学性质研究该酶反应晟适口H5，最适温度60℃。根据sDs—PAGE
电泳和酶的功能分析，证明目的蛋白已在尸fcA抽p∞fDr括中成功实现表达，并且酶的表达量
高丁国内外文献的相关报道。
关键词：里氏小霉：甘露聚糖酶：毕赤酵母
Abstract
endo—wise the
Bela。Inannanase(endo一1，4一Bmmannanase；EC3．2．1，78)catalyzes of
hydrolysis
backboneofmannanand seco聪mostab臻d黼l
hele∞辑ann8藏s，whic珏棚≈掘e bemicell珏lose
in ofmannanasein duck
polysaccharidesnature．Dietarysupplementation andnsh
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