实验四血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳要点.pptVIP

实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 烟大化院 贺君 实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 cellulose acetate membrane electrophoresis 实验四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 【实验目的】 掌握电泳法分离血清蛋白质的原理 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象 电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术 【实验原理】 H＋ OH－ H＋ OH－ pHpI pH=pI pHpI 电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即 V—粒子运动的速度 X—电场强度 Q—粒子所带电荷 r—粒子的半径 η—介质的粘度 影响电泳速度的因素 1.样品本身： 分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦越小，u越大。 球形分子 纤维状分子 Q越多，u越大； 分子小，r越小，u越大； 2.缓冲溶液： pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大 离子强度(I)： I越大，电动电势越小，u越小； I越小，电动电势越大，u越大， 但样品易扩散。 离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定 选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。 电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。 3.电场强度(X) X越大，u越快。 支持物越短， X越大， u越快。 电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离 4.支持介质： ①纤维薄膜(玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜) ②凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶) 负极 正极 － － － － － － － － 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。 电渗作用： 电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 以纸电泳为例: 区带电泳的分类 （一）支持物物理性状 1．滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜)电泳 2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳； 3．凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳； 4．丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。 （二）支持物装置形式： 1．平板式电泳：支持物水平放置； 2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳； 3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳 (三)pH连续性： 1．连续pH 电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。 2．非连续pH 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等 醋酸纤维薄膜为支持物 pH=8.6的巴比妥缓冲液 血清蛋白的pI均小于8.6 负电荷 电泳时向正极移动 由于迁移率不同而被分离 γ β α2 α1 清蛋白 分子越小，泳动速度越快 带电量越多，泳动速度越快 膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。 2.定性,定量 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 醋酸纤维薄膜： 醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜 广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析 血清蛋白、血红蛋白、球蛋白 脂蛋白、糖蛋白 甲胎蛋白、类固醇及同工酶等 优点： 简单快速 缺点 分辨率较低（聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGE） 不适于制备（薄膜厚度约10～100μm，样品用量很少） 【器材及试剂】 1、器材： 醋酸纤维薄膜（2×8cm） 常压电泳仪 竹镊 点样器 人血清或鸡血清 粗滤纸 2、试剂： 巴比妥缓冲液 氨基黑10B0.25染色液 漂洗液 透明液 [操作] （一）仪器与薄膜的准备 1、醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 2.电泳槽的准备 3、电极槽的平衡 （二）点样 取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上 点样区距阴极端1.5 cm 血清均匀涂在点样器表面 将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内 形成一定宽度、粗细均匀的直线 实验的关键，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节 （三）电泳 点样端薄膜平贴阴极电泳槽支架滤纸桥 (点样面