NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定.pdfVIP

中国农业科学 2012,45(19):4102-4108 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.19.023 NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定 1,2 2 2 2 2 2 杨少华 , 何洪彬 , 杨宏军 , 陈方园 , 高运东 , 仲跻峰 1 2 （山东省农业科学院畜牧兽医研究所/ 山东省动物疫病防治与繁育重点试验室，济南 250100 ； 山东省农业科学院奶牛研究中心，济南 250100 ） 摘要： 【目的】 通过反向遗传技术结合RNAi 筛选和蚀斑克隆方法，拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。 【方法】 以野生型轮状病毒 CHLY 基因组 RNA 为模板，通过重叠 PCR 方法在 NSP4 基因 93—104 nt 引入 5 个沉默突变核苷酸，并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变，构建了含有突变位点的 转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带 RNA 聚合酶基因的重组质粒 pcDNA3.1/T7-RNAP 共转染已接种野生型 RV 病毒的 MA104 细胞单层，继续培养 24 h，获得了携带 NSP4 变异基因的 RV 病毒粒子和野生型 RV 病毒粒子的混 合病毒。将获得的混合病毒接种 MA104 细胞，通过 RNA 干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救 RV。 【结 果】 成功拯救出了NSP4基因变异的RV，该病毒在MA104 细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。 【结论】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV；NSP4毒力位点135aa、136aa 和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。 关键词：轮状病毒；反向遗传技术；NSP4基因 Rescue and Identification of the Recombinant Bovine Rotavirus with Mutational NSP4 Gene 1,2 2 2 2 2 2 YANG Shao-hua , HE Hong-bin , YANG Hong-jun , CHEN Fang-yuan , GAO Yun-dong , ZHONG Ji-feng 1 ( Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Lab of Animal 2 Dairy Cattle Research Center，Shandong Provincial Academy of Agricultural Disease Control and Breeding, Ji’nan 250100 ； Sciences, Ji’nan 250100) Abstract: 【Objective 】The objective of the study is to rescue the attenuat