Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与植物挥发物的结合特征.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(10):1955-1961 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.10.008 Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与植物挥发物的结合特征 1 2 1 1 1 2 吴 帆 ，张晓曼 ，赵 磊 ，崔旭红 ，李红亮 ，罗 晨 1 2 （中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检疫检验重点实验室，杭州 310018 ； 北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097） 摘要：【目的】克隆Q型烟粉虱（ Bemisia tabaci ）化学感受蛋白1（chemosensory protein 1，CSP1）基因， 诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白（以下简称 BtCSP1），研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方 法】利用全长引物通过RT-PCR 扩增并克隆Q 型烟粉虱CSP1 基因ORF全长，连接并构建pET-30a(+)原核表达载体， 转化入 BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，并用 IPTG 诱导表达 BtCSP1 重组蛋白。收集菌液后超声破碎细胞，离心 取上清，经 Ni2+-琼脂糖柱结合梯度浓度咪唑洗脱纯化后，经 PBS 反复透析获得重组蛋白，并用 Bradford 法测定 重组蛋白浓度。采用常见的N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN）荧光探针作为报告子，利用荧 光竞争结合法研究重组 -1 BtCSP1蛋白与植物挥发物的结合功能。首先用1 mmol·L 1-NPN滴定 BtCSP1蛋白溶液，直 至蛋白最大发射波长处的荧光值完全猝灭为止，然后再以各供试配基滴定 BtCSP1-1-NPN体系，通过配基竞争猝灭 1-NPN最大发射波长，并用Scatchard等方程计算表征 BtCSP1与配基亲和力大小的解离常数 K 。【结果】克隆了 Q D 型烟粉虱 CSP1 基因 ORF 全长，经双酶切和连接构建了 pET-30a(+)/CSP1 重组质粒，在 IPTG 终浓度为 1 mmol·L-1 2+ -1 的条件下诱导获得了 BtCSP1 重组蛋白，Ni -琼脂糖柱纯化透析后测定重组蛋白浓度，稀释至1.5 µmol·L 作为工 作浓度。在荧光光谱试验中，Scatchard 方程线性化后（相关系数达到 0.9967），显示 BtCSP1 与 1-NPN 的解离常 数 -1 K1-NPN 为2.78 µmol·L ，结合位点数n为0.82，表明两者结合较好，且基本是1:1结合，适合作为本试验中竞争 性荧光结合试验的报告子。在荧光竞争结合试验中，有多种供试植物挥发物分子能使 1-NPN 的相对荧光强度降低 到 50%以下，其中包括能引起烟粉虱趋避行为的化合物，如 3-蒈烯、p-伞花烃、顺-3-己烯-1-醇和 α-蒎烯（KD -1