Sall4表达调控及其启动子核心调控区的筛选.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(1):176-185 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.01.016 Sall4 表达调控及其启动子核心调控区的筛选 王亚娴，杨 藩，王华岩 （西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100 ） 摘要：【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子，对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪 Sall4 的表达和转录调控机制，克隆了猪 Sall4 启动子，对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组 中克隆获得2.1 kb Sall4 启动子片段，并构建相应的报告载体；将报告载体pE2.1转染不同种类的细胞，进行细 胞特异性表达检测；采用实时荧光定量 PCR 方法，检测 Sall4 在猪不同组织和细胞中的表达变化；通过生物信息 学方法，分析 Sall4 启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点；将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、 Myc、Esrra/b 和Smad与 Sall4 启动子共转染293T细胞，利用双萤光素酶报告系统检测 Sall4 启动子活性；采用 DNA片段缺失的方法，构建一系列 Sall4 启动子片段缺失报告载体，将缺失片段载体分别转入293T 细胞中，并利 用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性。【结果】Sall4 在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中：包括P19、 293T、CHO 和 Hela 等细胞中特异性高表达。另外，通过实时荧光定量 PCR 检测结果显示，Sall4 的表达具有明显 的组织特异性，其在猪 iPS 细胞和生殖相关组织，如睾丸和卵巢组织中表达最高，而在脑、心、肝和肌肉等组织 中的表达较低，表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系。应用JASPAR和GPMiner 软件分析发现，Sall4 启动 子上有 TATA box、GC box、CAAT box 等顺式作用元件，以及 Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3 和 Smad 等多能转录因子的预测结合位点。其中，Oct4、Sox2 和 TGF-beta 信号通路因子对 Sall4 启动子活性有较显著的 激活作用，与对照组比较 Sall4 启动子活性提高了3倍；而Klf4因子对 Sall4 启动子活性有一定的抑制作用。采 用分段PCR的方法，对2.1 kb启动子进行了片段缺失，分别构建了pL2.1、 pL1.0和pL0.5等3个报告载体，检 测结果发现，在pL2.1与pL1.0之间相差1 kb左右，但是启动子的活性没有显著差异。载体pL1.0与pL0.5 之间 多了486 bp片段，启动子活性提高了1倍多。另外，pL0.5的启动子活性与对照组比较提高了8倍。这些结果表 明，猪 Sall4 启动子在-367 至-852 bp和-1 至-366 bp两个区域内存在核心调控区。【结论】克隆了猪Sall4 启动 子，证明 Sall4 的表达具有明显的组织特异性；Sall4 启动子序列上存在众多潜在的转录因子结合位点和启动子 核心调控域，是参与调控 Sall4 表达的重要序列，这些转录因子与 Sall4 相互作用对Sall4在多能细胞中的表达 调控发挥重要作用。 关键词：猪；Sall4；启动子；多能性；转录调控 Expression and Regulation of Sall4 and Screening Core Regulation Region of Sall4 Promoter WANG Ya-xian, YANG Fan, WANG Hua-yan (College of Veterinary Medicine, Northwest AF University, Yangling 712100, Shaanxi) Abstract: 【Objective 】Sall4