打顶烟草根尖组织抑制性消减cDNA文库的构建及其序列分析.pdfVIP

中国农业科学 2011,44(7): 1331-1337 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.07.004 打顶烟草根尖组织抑制性消减cDNA 文库的构建及其序列分析 1,2 1 2 1,2 戚元成 ，马 雷 ，王菲菲 ，刘卫群 1 2 （河南农业大学烟草学院，郑州 450002 ； 河南农业大学生命科学学院，郑州 450002 ） 摘要： 【目的】构建烟草打顶后根尖组织的消减文库，寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因。【方法】以 打顶株为测验子（tester）、以非打顶株为驱赶子（driver），利用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）和反向 Northern 杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库，并对差异表达克 隆进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA 文库。PCR 验证消减文库阳性克隆的插入片段为 200—1 000 bp 。经反向Northern 杂交，从850 个克隆中筛选到 560 个杂交信号差异明显的克隆，测序后得到 273 条有效序列。对273 个已知功能基因的ESTs 进行分类，生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转 导和转录因子类占 18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%、碳代谢占6%、其它代谢占15%、功能未知类占 13%。RT-PCR 结果显示，NTAT84 和NTAT71 序列在烟株打顶后转录活性均升高。【结论】应用SSH 技术构建了烟 草打顶前后根尖组织消减cDNA 文库。 关键词：烟草；烟碱；抑制性消减杂交(SSH)；反向Northern 杂交；序列分析；反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) Construction and Analysis of Roots Suppression Subtraction Hybridization cDNA Library After Tobacco Topping 1,2 1 2 1,2 QI Yuan-cheng , MA Lei , WANG Fei-fei , LIU Wei-qun 1 2 （College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002 ；College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002） Abstract: 【Objective 】 This study was carried out to construct suppression subtractive hybridization(SSH) library of tobacco roots after topping and to search some candidate genes involved in regulation of nicotine biosynthesis. 【Method 】An sSSH library