大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(11):2165-2175 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.008 大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性 曹可可，刘 宁，马双新，曹志艳，梁东旭，柴江婷，董金皋 （河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室，河北保定 071001 ） 摘要：【目的】优化大斑刚毛座腔菌（ Setosphaeria turcica ）高产漆酶的最佳发酵条件，确定其酶学性质， 为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株，首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的 碳源、氮源及铜离子的种类及范围，并在单因素试验的基础上，以漆酶酶活力为响应值，采用central composite design（CCD）响应面设计试验，利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析， 优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分；初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶，以ABTS为反应底物， 设置不同温度及pH，测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性，进一步测定其反应动力学常数 Km 值、 Vm 值，确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型，模型差异显著（P=0.0001）， 可以用该模型来拟合试验；响应面分析结果表明，各因素对漆酶活力的影响大小依次为 Cu2+葡萄糖尿素，而葡 萄糖和尿素交互作用极显著；通过拟合求出模型极值点，对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄 糖50.05 g∙L-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 ，KHPO 1 g∙L ，尿素1.46 g∙L ，MgSO 0.5 g∙L ，蛋白胨2 g∙L ，玉米浆0.5 g∙L ，CuSO 0.07 g·L ， 2 4 4 4 Tween80 3 mL∙L-1 -1 ，28℃，150 r/min振荡培养 7 d；在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U∙mL 。对大斑刚 毛座腔菌漆酶发酵液初步分离，经 SDS检测其漆酶相对分子量约为 80 kD；以 ABTS 为底物时，最适反应温 度为 50℃，最适 pH 为 4.2，在温度较高且弱酸性条件下活性较高，并且具有良好的温度稳定性和 pH 稳定性，常 温下pH为4.2 保持14 h后酶活力基本不变，50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上；进一步在常温、pH 为 4.2 时测定其米氏常数 -1 -1 -1 Km 值为 0.036 mmol∙·L ，最大反应速率 Vm 为 28.63 mmol∙L ∙min 。【结论】利用大斑刚毛 座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性，表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性 高、稳定性好等特性，可进一步研究开发应用。 关键词：大斑刚毛座腔菌；漆酶；响应面；酶学性质 Optimization of Fermentation Condition for Laccase Production by Setosphaeria turcica Using the Response Surface Methodology