氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(11):2251-2261 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.11.019 氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA 试剂盒的研制 1,2 1 2 1 1 1 1 1 1 贾国超 ，职爱民 ，李梦琴 ，宋春美 ，王玲玲 ，刘儒彪 ，胡骁飞 ，王方雨 ，张改平 1 2 （河南省农业科学院/农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室，郑州 450002 ；河南农业大学食品科学技术学院，郑州 450002 ） 摘要：【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE ）人工抗原，制备FLE 高亲和力抗体，通过建立、优 化FLE 的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE 残留检测间接竞争ELISA 试剂盒。【方法】用DCC 法偶联FLE 和载体蛋白BSA 合成免疫原FLE-BSA，用混合酸酐法偶联FLE 和载体蛋白OVA 合成包被原FIE-OVA，通过紫外扫描 法（UV Scan ）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA 免疫 SPF 级6—7 周龄Balb/c 雌性小鼠5 只，采用多点免疫法，对小鼠背部皮下4-6 点注射免疫，免疫剂量为30 μg/ 只，初免，用FLE-BSA PBS 溶液与等体积FCA 混合乳化后免疫；20 d 后用FLE-BSA PBS 溶液与等体积FIA 混合乳 化后免疫，免疫间隔 3 周，4 次免疫后，利用间接ELISA 和间接竞争ELISA 测定其多抗血清效价和敏感性，选出 效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清，建立、优化FLE 的icELISA检测方法，确定其包被浓度、包被时间、封闭 液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件，制备出FLE 快速检测试剂盒，同时测定 该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标，并与高效液相色谱法做相关性比较，同时对市场上购买 4 个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定，以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接 技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定，结果显示BSA 与FLE 偶联后，FLE-BSA 波峰整体出 现右移且凝胶上BSA 的泳动速度大于FLE-BSA，初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA 和间接竞争ELISA 4 -1 方法测定5 号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×10 ，抑制价为162.18 ng·mL 。通过优化FLE icELISA 检测方法， -1 其工作条件：包被浓度：5 μg·mL ；抗体工作浓度：1 ﹕6400；二抗稀释度：1 ﹕1000；底物显色时间：10 min。 -1 2 所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng·mL ，标准曲线回归方程为y= －0.3627x + 1.3517 （R = 0.9956 ），与同系药 物及其它药物均无明显交叉反应，阳性猪肝样的回收率在67.5%—87.9%，平均78.7%，变异系数在9.34%—10.7%， 平均 10.0%；阳性猪肉样的回收率在74.0%—88.2%，平均81.42%，变异系数在8.3%—10.4%，平均9.48%；平均 变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng·mL-1 5 个标准浓度 B/B0 的批内变异系数在