高效、新T-DNA侧翼序列分离技术——Actail-PCR.pdfVIP

中国农业科学 2009,42(4):1447-1451 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.04.040 高效、新T-DNA侧翼序列分离技术——Actail-PCR 1 1 2 2 1，2 杨立勇 ，刘灶长 ，周立国 ，罗华程 ，罗利军 1 2 （上海市农业生物基因中心/作物遗传改良国家重点实验室种质资源分室（上海），上海 201106 ； 华中农业大学，武汉 430070 ） 摘要：【目的】建立一种有效分离T-DNA插入突变体侧翼基因组序列的方法。【方法】分离侧翼的目标基因组 序列是利用T-DNA标签法研究植物功能基因组学的一个关键步骤，笔者发展稳定高效的Actail-PCR分离技术。该 技术一侧引物来自于T-DNA 载体，另一侧引物为一个复性控制引物。复性控制引物在3端为一个 14 bp的随机简 并引物，在5端非目标尾部序列接上一个通用引物，中间由5个多聚脱氧次黄嘌呤核苷（poly（dI））连接。【结 果】Actail-PCR技术将随机简并引物重新编辑成复性控制引物，在40℃的低严谨条件下，3端的随机简并引物可 以与T-DNA插入突变体的侧翼目标区段随机的结合，扩增得到目标片段，随后利用5端的通用引物与T-DNA载体 上的巢式引物依次组合，在 65℃（10 个循环后逐步降温至 58℃）的高严谨条件下逐步扩增特异片段，同时抑制 非特异性扩增，可以显著提高目标片段的扩增效率，减少假阳性。【结论】相对传统的 TAIL-PCR，Actail-PCR 技 术可以更高效地分离T-DNA 插入突变体的侧翼基因组序列。 关键词：T-DNA；侧翼序列；TAIL-PCR；Actail-PCR Actail-PCR—A New and Efficient Procedure for Isolation of Unknown Target Sequences Adjacent to T-DNA Border 1 1 2 2 1,2 YANG Li-yong , LIU Zao-chang , ZHOU Li-guo , LUO Hua-cheng , LUO Li-jun 1 ( Shanghai Agrobiological Gene Centre/Germplasm Resources Division (Shanghai), National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement , Shanghai 201106; 2Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070) Abstract: 【Objective 】 This study aimed at establishing a protocol to identify unknown target sequences adjacent to T-DNA borders. 【Method 】 DNA tagging by T-DNA insertions has become an important approach for study of functional genomics in plants. To identify the genes tagged by T-DNA insertions,