家蚕组织蛋白酶O（BmCatO）基因鉴定及表达分析.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(22):4564-4573 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.22.016 家蚕组织蛋白酶O（BmCatO）基因鉴定及表达分析 苏晶晶，陈思源，张 奎，余 霜，李钰添，梁航华，赵羽卒，晁会娟，崔红娟 （西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716 ） 摘要：【目的】克隆家蚕（ Bombyx mori ）蛋白酶 O 基因 Cathepsin O（BmCatO），分析其 mRNA 表达特征，通 过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，为进一步探究组织蛋白酶 O 在家蚕变态发育中 的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长cDNA序列,然后采用RT-PCR对其时空 表达特征进行研究。从NCBI 下载其他物种组织蛋白酶O 基因序列，利用Clustalx和 MEGA 6.0软件进行同源比对 和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物，将PCR扩增产物连接至PET32a质粒，转化至 E. coil 表达 菌株Rosetta(DE3)，经IPTG 诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白，然后利用Ni+ 亲和层析方法对重组蛋白进行纯化， 最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上，scaffold 为nscaf2943，基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式，剪切体1开放阅读框（ORF）全长为1 071 bp， 编码356个氨基酸，预测蛋白分子量36 kD,等电点8.594；剪切体2 ORF全长为942 bp，编码313个氨基酸，预 测蛋白分子量40 kD，等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成，剪切体2的第六外显子出现 部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似，均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表 明，无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类，且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟（ Chilo suppressalis ） 组织蛋白酶O 最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞，剪切体1的表达水平明显高于剪 切体 2，但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶 O 原核表达系统，利用亲和 层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶 O 重组蛋白，并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，ELISA 显 示其效价高达到 1 ﹕1 280 000。Western 印迹结果表明，该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶 O 重组蛋白。 【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整cDNA序列及表达特征，经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白， 通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。 关键词：家蚕；蛋白酶O基因；克隆；时空表达；抗体制备 Identification and Expression Analysis of Cathepsin O Gene in Silkworm (Bombyx mori) SU Jing-jing, CHEN Si-yuan, ZHANG Kui, YU Shuang, LI Yu-tian, LIANG Hang-hua, ZHAO Yu-zu, CHAO Hui-juan, CUI Hong-juan (State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716) Abstract: 【Objective 】The objectives of thi