生化实验(七)综合性实验之三血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳摘要.pptVIP

综合性实验三血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义; 2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的操作技术; 3.熟悉电泳仪器的使用和操作。 一、实验目的： 二、实验原理： （一）电泳(electrophoresis) ：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极方向泳动的现象。 正极 负极 带负电粒子 带正电粒子 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 1. 球形带电颗粒在电场作用下所受的力 电场力 F = XQ (X－电场强度，Q－粒子所带电荷) 阻力 F = 6πrηv (r－粒半径，η－介质粘度，v－粒运动速度) 当 F= F，(电泳达平衡)，XQ = 6πrηv 移项得 v / X = Q / 6πrη 迁移率 (mobility) : U = v / X = Q / 6πηr v / X , 单位电场强度时粒子运动的速度 带电粒子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质：即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。 移动速度: v = d / t (cm / 秒) 电场强度: X = E / l (伏特 / cm) (单位距离内电势差) d / t E / l d l Et 2. 两种不同物质的电泳分离 迁移率U = v / X = —— = —— (单位: cm2·伏特-1·秒-1) 物质 (A) 在电场中移动的距离为dA = UA · Et / l 物质 (B) 在电场中移动的距离为dB = UB · Et / l 两物质移动距离的差为 Δ d = dA - dB = (UA – UB) · Et / l 物质 A 和 B 能否分离取决于两者迁移率。 如两者的 U 相同，则不能分离；如有差别则能分离。 两物质的分离距离：与电压和电泳时间成正比，与电场的距离成反比。 小结： 带电粒子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质：即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。 两物质的分离距离：与电压和电泳时间成正比，与电场的距离成反比。 电泳法：利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的方法和技术。 （二）影响电泳速度的因素 ⒈ 样品本身 带电量：Q 越多，v 越大。 分子大小： r 越小，v 越大。 形状：球形分子 纤维状分子。 ⒉ 电场强度：X 越大，v 越大。 d = U · Et / l U = v / X = Q / 6πηr V = d / t = U · E / l = U · X = Q · E / (6πηr · l ) ⒊ 缓冲液 成分：性质稳定，不易电解。 pH：pH - pI 越大，Q 越多，v 越大。 离子强度：0.02～0.2M。I 越大，样品电流减小，v 变小；I 越小，样品电流越大，v 越大，但样品易扩散。 ⒋ 支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，易保存；吸附力要小；无电渗作用。 电渗：液体对固体的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。电渗与电泳方向相同，v 变大；反之变小。 简言之，在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。 原因： 固体支持物多孔，带可解离化学基团，常吸附溶液中正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。 如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH- 带负电荷；而与纸接触的水溶液因产生H3O+带正电荷。 因此，若样品质点在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点是移向正极，则表现速度比其固有速度要慢， 可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。甚至，当电渗作用大于电泳时，样品质点可“不进反退”，向电泳相反方向移动。 附：电渗 ⒌ 温度：过高，产热增加、水分蒸发，对电泳不利。 产生热量(Q=I2Rt)对电泳技术不利，因产热可促使支持介质上溶剂蒸发，而影响缓冲溶液离子强度。 温度升高，介质粘度下降，分子运动加剧，自由扩散变快，迁移增加。 为降低热效应对电泳影响，可控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。对高压电泳增设冷却系统，防样品变性。 ■ 影响电泳迁移率的因素： Friction Charge 外加电流、电压 分子量 分子形状 分子的等电点 Voltage CATHODE ANODE + - - + Friction Charge 在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。 血清中各种蛋白质的等电点在pH4.0～7.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。 血清中各种