利用寄主诱导的基因沉默技术验证大丽轮枝菌糖代谢相关基因的致病力.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(7):1321-1329 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.07.07 利用寄主诱导的基因沉默技术验证大丽轮枝菌 糖代谢相关基因的致病力 赵玉兰，苏晓峰，程红梅 （中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081 ） 摘要：【目的】筛选大丽轮枝菌( Verticillium dahliae)糖代谢相关基因，证实其与大丽轮枝菌的生长发育 和致病性相关,为防治由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病提供理论基础。【方法】利用寄主诱导的基因沉默 （host-induced gene silencing，HIGS）技术对大丽轮枝菌糖代谢相关基因进行筛选。将单个或多个含靶标基因 的病毒载体注射本氏烟草瞬时表达基因，7—10 d 后八氢番茄红素脱氢酶 PDS 会出现明显的烟草白化症状，蘸根 法接种大丽轮枝菌 V.d991，对应的大丽轮枝菌靶标基因会被干扰，接菌 14 d 后，观察转基因烟草表型，统计烟 草病情指数，同时利用荧光定量 PCR 技术检测转基因烟草中大丽轮枝菌 V.d991 的生物量和靶标基因 VDPDF-1、 VDEG-1、VDMAN-1 和 VDPD-1 的表达量。【结果】HIGS 方法快速筛选获得大丽轮枝菌 4 个糖代谢相关基因，分别为 VDPDF-1、VDEG-1、VDMAN-1 和 VDPD-1，相比空载体对照，转化这4个靶标基因的烟草病情指数分别降低了35%、 30%、20%和 10%，混合注射 VDEG-1/VDPDF-1、VDPD-1/VDPDF-1/VDMAN-1、VDPD-1/VDMAN-1、VDPD-1/VDPDF-1 和 VDEG-1/VDPD-1 的转基因烟草病情指数分别降低了45%、45%、40%、40%和35%，除VDPD-1 转基因烟草外，其余转 基因烟草与注射空载体的阴性对照相比病情指数都有显著降低。接种后大丽轮枝菌在寄主体内的生物量和干扰后 靶基因表达量也有不同程度降低，混合基因注射比单基因注射干扰效果降低更明显,其中生物量降低最显著的是混 合注射的EG/PDF(VDEG-1/VDPDF-1)和EG/PD(VDEG-1/VDPD-1)，生物量的降低可达0.94,干扰大丽轮枝菌的靶标基 因后，表达量降低最明显的是混合注射PD/PDF(VDPD-1/VDPDF-1)中 VDPDF-1，降低了0.91。【结论】HIGS方法快 速筛选到大丽轮枝菌糖代谢相关的 4 个基因 VDPDF-1、VDEG-1、VDMAN-1 和 VDPD-1，当其被干扰后，转基因烟草 的病情指数降低，抗病性增强，而且混合注射多个基因载体比单基因注射效果更为明显，证实这些糖代谢相关的 基因与大丽轮枝菌的致病性相关。 关键词：基因沉默；大丽轮枝菌；致病性；生物量；干扰效果 Verification of Verticillium dahliae Pathogenicity of Glycometabolism Related Genes by Using Host-Induced Gene Silencing Method ZHAO Yu-lan, SU Xiao-feng, CHENG Hong-mei (Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081) Abstract: 【Objective 】 The objective of this study is to screen glycometabolism related genes from Verticillium dahliae, confirm