野油菜黄单胞菌hl-3抗药性质粒转化和产胶基因xana基础研究.pdfVIP

野油菜黄单胞菌HIIL．3抗药性质粒转化和产胶基因XanA基 础研究 摘要 黄原胶(Xanthan c翩pestrJs)以碳水化合物为主要底物，经发酵产生的一种酸性胞外 杂多糖。 本课题主要研究了野油菜黄单胞菌嘣L一3的感受态细胞的制备、 带有抗药性质粒的转化、菌种基因组DNA提取方法的建立和酶切及产 胶基因XanA片段的PCR扩增。 细菌转化率决定于细菌被质粒转化的能力以及细菌的数量，随着 细菌生长，单位体积内的细菌数目增加，但细菌被质粒转化的能力有 所下降，尤其当生长过度后下降为明显。因此，合适的生长浓度应该 保证上述两方面的综合效应处于理想范围。对于野油菜黄单胞杆菌， 最高转化率在A。。。为0．55左右为最高。 感受态制备和转化时采用的转化液组成是研究最多的，本研究表 明，CaCI：的使用浓度以lOOmmol／L为最佳，这与肖庚富等研究结果相 一致。曾有报道以TFB溶液和TB溶液为转化液并与复杂的制备方法或 低温培养相结合，获得了高达108的转化率，但是复杂的操作以及低温 培养时较慢的细菌生长速度往往不利实验操作。 在综合考虑影响感受态细胞转化率的各种因素的基础上，本研究 提出了制备感受态细胞的标准方案，采用此方案我们获得了转化率为2 X107 ×106-4cfu／ugDNA的野油菜黄单胞菌感受态细胞，可完全满足菌 种抗药性和分子克隆对感受态细胞的要求。 用去污剂SDS和CTAB破坏细胞膜结构，使胞内核酸释放，用酚／ 氯仿／异戊醇去除蛋白质，异丙醇沉淀DNA，TE溶解DNA。采用此SDS ?(bali酶切消化。本方法能快速简便提取野油菜黄单胞菌DNA，提取的 DNA含量较高、纯度较好，比试剂盒更经济，也可用于酶切分析、构建 文库及PCR扩增。 XanA基因是直接影响黄原胶结构和组成的一类结构基因，并且 XanA基因与黄原胶(或EPS)生物合成的后期过程相关。本章研究的主 要内容是根据从互联网上的基因数据库中查阅获得XanA基因的核苷酸 序列来设计相应的引物，以黄原胶菌株基因组DNA为模板，通过对PCR 条件的优化实验从而扩增得到XanA基因。由于是本课题组首次尝试在 基因工程方面的研究，所以主要是集中在产胶基因的基础性研究。进 行野油菜黄单胞菌XanA产胶基因PCR扩增程序的优化结果显示各个反 应体系的最佳添加量为：cDNA模板浓度为3一、M92+浓度为3啦、引物 数量2¨l、循环次数设定为35、退火温度为55。C。结果表明引物对XanA 表现出很强的特异性，基因条带的大小约为1．5Kb，和基因文库的XanA Il 基因大小基本保持一致。条带经凝胶分析系统分析条带和基因文库的 大小比较一致，且纯度较高，可以为以后的进一步测序和克隆构建使 用。 关键词：野油菜黄单胞菌，转化，感受态细胞，基因工程，PCR II| onthe translationand Pr studiesdruc-fastplasmid imary HHL一3 XanA ofXanthomonascampestris gene ABSTR^CT Xanthanisan whichcould gum exosporeheteropolysaccharide fromXatJt]?omonas the of beprepared campestrisby process fermentationin asmainsubstrate． carbohydrate