脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(22):4539-4550 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.22.014 脂代谢通路对鸡雄性生殖细胞分化的调控机制 左其生，张 蕾，连 超，肖天荣，王颖洁，汤贝贝，王 飞，纪艳芹， 路镇宇，赵瑞峰，张文慧，张亚妮，李碧春 （扬州大学动物科学与技术学院/江苏省动物繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州 225009 ） 摘要：【目的】探索家鸡雄性生殖细胞分化过程中脂代谢相关基因以及信号通路的调控机制，以期为完善体 外诱导体系提供依据。【方法】采用流式细胞分选法获得纯度较高的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)、原 始生殖细胞(primitive germ cells，PGC)和精原干细胞 (spermatogonial stem cell，SSC)，提取细胞总RNA。 利用RNA-seq 高通量分析方法对这三种细胞进行转录组水平测序，进行GO（Gene ontology）分析和KEGG通路富 集，寻找脂代谢相关基因以及信号通路；并利用脂代谢--视黄醇代谢通路终产物视黄酸（retinoic acid，RA）以 及抑制剂苯磺酰异羟肟酸 (piloty’s acid)在体外诱导ESC向雄性生殖细胞分化和体外鸡胚注射后孵化，qRT-PCR （quantitative real time PCR）检测视黄醇代谢通路上差异基因的表达变化，与 RNA-seq 结果进行比较分析同 时检测雄性生殖细胞标记基因的变化情况。【结果】GO功能显著性富集和 Pathway 显著性富集分析结果发现：在 ESC向SSC分化过程中共存在328个基因持续参与脂代谢调控，富集到27 条脂代谢通路中，包括视黄醇代谢、初 级胆汁酸的合成、甾类激素的生物合成、脂肪酸代谢、甘油酯代谢以及类固醇的生物合成等通路。在视黄醇代谢 通路中 ADH5 在 PGC中特异表达，ALDH1A1 在整个发育过程中持续上调，ADH5 和 ALDH1A1 在细胞中参与视黄酸的合 成；CYP26b1 在整个发育过程中持续上调，参与视黄酸的降解过程；RA 体外诱导 ESC 向 SSC 方向诱导试验结果表 明 ADH5、ALDH1A1 和 CYP26b1 家族基因在体外 RA 诱导过程中变化与体内分化过程一致，RA 诱导组产生的 SSC 样 细胞显著高于控制组和 Piloty’s Acid+RA 组。鸡胚注射抑制剂试验结果表明视黄醇通路被抑制后孵化至 18d 后 SSC细胞表面特异标记基因 integrinα6 和 integrinβ1 的表达水平显著的低于正常的孵化组(CON)和阴性对照组 （BLANK）【结论】脂代谢--视黄醇代谢通路在家鸡雄性生殖细胞的分化过程中起重要作用，体外利用视黄醇代谢 通路终产物RA 进行诱导时第2天出现类胚体，第4、6天类胚体逐渐增大，第8天开始裂解，在第10 天出现SSC 样细胞，而在诱导过程中抑制视黄醇通路信号后则会降低 SSC 样细胞的产生，而在体外孵化过程中视黄醇通路抑 制后也能影响SSC细胞的产生。 关键词：鸡；RNA-seq；雄性生殖细胞；视黄酸；脂代谢 The Regulatory Mechanism of the Lipid Metabolism Pathways During Male Germ Cell Differentiation in Chickens ZUO Qi-sheng, ZHANG Lei, LIAN Chao, XIAO Tian-rong, WANG Ying-jie, TANG Bei-bei, WANG Fei, JI Yan-qin, LU zhen-yu, ZHAO Rui-feng, ZHANG Wen-hui, ZHANG Ya-ni, LI Bi-chun (Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Pro