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B7-1 人- 鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应及分子机制的研究 中文摘要 中文摘要 B7-1 （又称CD80 ）是主要表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)表 面的重要共刺激分子。B7-1与相应的受体CD28结合，介导的共刺激信号，是T、B 细胞活化、增殖、分化进而发挥免疫效应所必需的。缺乏该信号，T 细胞将进入 无反应状态（Anergy ）或免疫耐受（Tolerance ），甚至程序性死亡（Apoptosis ）。 自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID ）是自身反应性T、B 淋巴细胞过 度活化，导致大量自身抗体生成，进而累及多系统、多器官的一类严重疾病。系 统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是其典型代表。B7/CD28信号 通路的过度活化与自身免疫性疾病的发生密切相关，已有文献报道B7-1和B7-2单 克隆抗体可有效减少SLE模型小鼠免疫细胞的活化，自身抗体的生成，逆转SLE的 肾脏病理损伤。 嵌合抗体（chimeric antibody ）是由鼠源性抗体的可变区基因与人源性抗体的 恒定区基因拼接而成的嵌合基因，插入载体后转染至中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了人抗鼠 抗体反应(human anti-murine-antibody response ，HAMA) 的发生，成为了新的研究 热点。 本课题在建立和人红斑狼疮类似的慢性移植物抗宿主病（cGVHD ）小鼠狼疮 样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上，运用自行研制的B7-1 人- 鼠嵌合抗体 对该疾病模型进行干预。通过免疫学、血清学及肾脏组织形态学等指标动态评价 嵌合抗体对疾病模型的免疫干预效应，同时为该类疾病寻找新的高效、特异、低 毒的免疫干预手段。 一、B7-1 人-鼠嵌合抗体的制备及鉴定 目的：制备B7-1人- 鼠嵌合抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用细胞 大规模培养法制备嵌合抗体；Protein G免疫亲和层析法分离纯化抗体；流式细胞术 分析嵌合抗体对人及小鼠细胞膜型B7-1分子抗原表位的识别。结果：经Protein G 亲和层析柱分离纯化，细胞培养上清中嵌合抗体蛋白的得率约为25mg/L ；B7-1嵌 合抗体与L929-B7-1 、Daudi 以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为 94.2%、93.8% 及65.4% 。结论：本研究所用B7-1人- 鼠嵌合抗体既能识别人的B7-1分子抗原表位又 能识别鼠的B7-1分子抗原表位。 I 中文摘要 B7-1 人- 鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应及分子机制的研究 二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定 目的：构建cGVHD小鼠狼疮样肾炎模型，并通过免疫学、血清学和组织形态 学对其进行生物学鉴定。方法：将30只6~8周龄雌性( C57BL/ 6×BALB/ c)BCF1小 鼠随机分为2组，模型组于0、3、7和11d经眼眶静脉注射亲代BALB/c小鼠脾脏淋巴 7 细胞10 /100μL/ 只。对照组给予等体积生理盐水。末次注射后第7天，双色免疫荧 光及流式细胞术分析小鼠脾脏淋巴细胞活化情况；每2周定期检测小鼠血清中抗 dsDNA抗体及ANA含量；每4周试纸法定期检测尿蛋白含量。实验的第12周处死所 有小鼠，取肾脏HE染色观察肾脏组织病理改变，直接免疫荧光法检测免疫复合物 （IC ）的沉积情况及透射电镜法观察肾小球超微结构的改变。结果：模型组小鼠 + + + + 脾脏细胞抗原递呈细胞（MHC Ⅱ细胞）膜型CD11b ，CD11c 和Gr 1 的比例较对 照组明显上升（P0.05 ），抗体形成细胞（B220+ ）上B细胞表面活