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第三章生物催化剂的修饰与改造精要.ppt
2)增强酶的稳定性(热稳定性)。 α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后,该酶抗不可逆热失活的稳定性在60°可提高1000倍。这种稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活。 3)消除抗原性(针对特异性反应降低生物识别能力)。 4)产生新的催化能力。 木瓜蛋白酶用黄素共价结合修饰后,蛋白酶变成氧化还原酶。 1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应 试剂特点:烷基上带活泼卤素,导致酶分子的亲核基团(如-NH2,-SH等)发生烷基化。 可作用基团: 氨基(Lys,Arg),巯基(Cys),羧基(Asp、Glu),甲硫基(Met),咪唑基(His)。 修饰剂:2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应 2) 酰基化反应 试剂特点: 含有 结构,作用于侧链基团上的亲核基团,使之酰基化。 可作用基团: 氨基,巯基,醇羟基(Ser、Thr),酚羟基(Tyr) 酰基化反应 3) 氧化和还原反应 试剂特点:具有氧化性或还原性。 氧化剂:H2O2 ,N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团:巯基,甲硫基,吲哚基(Trp)、咪唑基,酚基等。 还原剂:2-巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团:二硫键。 蛋白质化学修饰的局限性 化学修饰的专一性是相对的; 酶的构象有些改变; 化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行 。 氨基酸酰化酶活性部位中的锌被钴取代时,酶的底物专一性和最适pH值都发生改变:锌酶对N-氯-乙酰丙氨酸的最适pH为8.5,而钴酶的最适pH是7.0;钴酶对N-氯-乙酰丙氨酸水解活力增强,而对N-氯-乙酰蛋氨酸的活力降低。 天然含铁超氧化物歧化酶的铁被锰取代,酶的稳定性和抑制作用发生显著变化,含锰酶对过氧化氢的稳定性增强,对NaN3抑制作用敏感性降低。 三、修饰酶的性质及特点 热稳定性:一般来说,热稳定性有较大的提高 抗原性:比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力:对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力,从而提高其稳定性。 半衰期:一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后,增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定期,从而延长了在体内的半衰期。 最适pH:大部分酶经化学修饰后,酶的最适pH发生了变化,这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境,在临床应用上有较大意义。 Km的变化:大多数酶经修饰后,Vm没有明显变化,但有些没经修饰后,Km值变大。 4)巯基的化学修饰 来源:Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂:碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X - E-SR +HX N-乙基马来酰亚胺(NEM)(常用的专一修饰巯基试剂) E-SH + ? 5) 二硫键的化学修饰 还原:巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT) 氧化:过甲酸: Performic acid 6)咪唑基的化学修饰 来源:His 修饰反应:酰基化与烷基化 酰基化修饰剂: 常用焦碳酸二乙酯(diethyl paracarbonate) + ? + C2H5OH +CO2? 烷基化修饰剂:碘乙酸 + ICH2COOH ? + HI 7)酚羟基的化学修饰 来源:Tyr 修饰反应:芳香环取代反应 修饰剂:碘、硝化试剂(四硝基甲烷) 8)吲哚基的化学修饰 来源:Trp 修饰反应:氧化反应 修饰剂: N-溴代琥珀酰亚胺 2-羟基-5硝基苄溴 N-溴代琥珀酰亚胺 吲哚基 Trp 碘、四硝基甲烷 酚羟基 Tyr 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 咪唑基 His 三硝基苯磺酸、丹磺酰氯;2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸 氨基 Lys 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基 Cys 巯基乙醇、DTT 二硫键 苯乙二醛,1,2-环己二酮、丁二酮 胍基 Arg 水溶性碳化二亚胺 羧基 Asp、Glu 修饰剂 侧链基团 氨基酸 各种氨基酸侧链的修饰剂 但解释修饰效果须十分小心,因为: ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活, 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团,修饰效果不同,分子内部的必需基团,不易被修饰。 (三)交联修饰
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