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NF．kB在葡萄膜巩膜房水外流通道的表达及其作ffJ的实验研究 NF．KB在葡萄膜巩膜房水外流通道的 表达及其作用的实验研究 专 业： 眼科学 学位申请人： 肖剑晖 导 师： 蓝育青副教授 中文摘要 青光眼目前己成为世界范围内第二位不可逆致盲性眼病。研究青 光眼的多中心临床随机对照试验结果表明，个体化眼压正常调控治疗仍 然是目前阻止病程进展的最有效手段。临床上青光眼眼压升高绝大部分 是因房水外流阻力增加所致。葡萄膜巩膜房水流出途径是房水的两条重 要排出途径之一，因此，研究葡萄膜巩膜房水流出通道的分子调控机制， 进一步了解青光眼的发病机理，丰富青光眼房水流出作用机制理论，为 青光眼的治疗提供新的、强有力的手段。 研究目的：观察曲伏前列腺素药物作用下，核转录因子N卜诎及Ir．B系 统对葡萄膜巩膜房水外流的分子调控，以及MMP一2在葡萄膜巩膜房水外 流通道的作用，力图阐明葡萄膜巩膜房水外流的分子机制。 研究方法：1、体外培养人睫状肌细胞并鉴定。2、人睫状肌细胞培养基 中加1uM曲伏前列腺素，根据孵育时间的不同分为4组，即Ohr组(对 照组)、6 hr组、12hr、24hr组。孵育至上述时间点时，分别收取细胞 孵育液及细胞，real—timeRT—PCR、和免疫荧光半定量分析分别检测上 述时间组NF—KBp65、IlcBⅡ、MMP一2在基因和蛋白水平的表达。 Zymography技术测定删P一2活性。 NF—kB在葡萄膜巩膜房水外流通道的表达及其作用的实验研究 研究结果： 1、 人睫状肌细胞培养和鉴定 1．1光镜组织块培养的睫状肌细胞，1周后细胞开始从组织块周边游离 出来，呈典型的梭形。组织块培养细胞融合后，组织块周围细胞呈漩涡 状排列，组织块间细胞呈峰谷样排列。 1．2细胞用SmoothmuscleCI—actin和Desmin免疫荧光反应均可见阳 性物质分布于胞浆中。形态学和免疫荧光鉴定证明所培养的细胞是人睫 状肌细胞。 2、real．time CI、MMP．2在不同时 RT-PCR法分别检测NF—vJ3p65、lv．．B 间组的基因表达 mRNA相对定量结果用LSD—t检验统计分析显示与对照组比较 d荧光强度 6hr、12hr、24hr组NF—v．Bp65均表达下降(p=0．001)：IvJ3 6hr组、12hr组较对照组改变不明显(p0．05)，24hr组较对照组增加 24hr组较对照组逐渐增加趋势(p=0．000)。 3、免疫荧光半定量分析 相同曝光时间、相同面积下对照组和各实验组的细胞荧光染色强度 应用LSD-t 组均较对照组减少(p=0．000)；Ir．BⅡ6hr组较对照组没有明显改变 显增加(p=0．001)：MMP．2荧光强度6hr组较对照组荧光强度减少 (p=0．305)，12hr、24hr组较对照组逐渐升高趋势(p=O．000)。 4、Zymography(明胶酶谱)技术检测各时间组MMP-2的活性 Zymography凝胶中可见一条MMP一2透明条带，分子量为72kDa， 对照组与6hr、12hr、24hr组MMP一2校正光密度值分别为10．23±5．06， 5223±6．87，10376+_2147，23721±39．72(n=4)；分别较对照组增加(n=4)， 实验各组MMP．2活性比对照组增强。(p=0．000) 实验结论：曲伏前列腺素作用于人睫状肌细胞后， NF-kB p65的基因 表达下调，InBCI的基因表达上调。NF．kB在葡萄膜巩膜房水流出通道 NF—kB在葡萄膜巩膜房水外流通道的表达及其作用的实验研究 中起负调控作用。曲伏前列腺素作用于人睫状肌细胞后，MMP．2的基 因表达上调。MMP．2活性随药物作用时间延长而增强。 关键词： NF—kB、Ird3、基质金属蛋白酶、葡萄膜巩膜、房水、拟前列 腺素药物