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中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：j互逊 日期： !!皇塑 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： ；、～!型缝塑苎一，； Oste叩ontin在脊髓运动神经元凋亡过程 中表达的变化及其意义 目 的 用“坐骨神经撕脱法”建立“脊髓运动神经元凋亡”的动物模型，检测损 OPN mRNA在脊髓运动神经元凋亡中的作用。 材料与方法 1．大鼠脊髓运动神经元凋亡模型的建立 良的Manin法制作坐骨神经椎管外撕脱导致脊髓运动神经元凋亡的模型。 先利用1．4％氟烷及1．5L／rnin氧气对动物行吸入麻醉，于左侧骨盆的外侧 和后肢的上部作正中切口，钝性分离股二头肌和臀肌，显露坐骨神经，然后 逆寻至骨盆深部，椎管外。用小血管钳将坐骨神经从椎问孔拉出，使其与脊 髓分离。放松肌肉，关闭切口。 2．组织标本采集 分别于术后1、3、7、14或2l天处死动物。在戊巴比妥麻醉下，通过灌 验鼠进行心内灌注。收集含有L。L4脊髓的组织块，于固定液中4cC过夜固 定，然后低温保护于含20％蔗糖的PBS溶液中过夜。用恒温切片机切取12 一斗m的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载玻片上。 3．Nissl染色 利用甲酚紫对切片进行染色。 4．原位杂交 5．原位杂交与荧光免疫组化双染色 原位杂交反应后，PBs清洗切片5min，然后与一抗在40C下反应过夜。 ．1． 一抗为单克隆小鼠抗NeuN抗体。切片用PBs冲洗三次以上，每次lOmin。 最后与Alexa荧光488共轭的羊抗小鼠IgG抗体反应并用荧光固定剂固定 于载玻片上。 6．免疫组化 如文献所述进行免疫组化反应。一抗是鼠抗神经细胞核抗体。 7．细胞计数(NeuN阳性神经细胞及表达0PN的细胞) 随机从切片中同侧及对侧的脊髓前角选取o．147mm2大小的范围，计数 NeuN和OPN阳性的细胞。 8．统计学分析 采用方差分析评估组间差异，并用Fisher最小显著差值(出D)检测方 法进行检测。P值小于o．05，有显著意义。 结 果 1．坐骨神经撕脱伤后运动神经元的减少 坐骨神经撕脱伤可造成脊髓运动神经元的逐渐减少。从伤后第3天 起，同侧(损伤侧)前角运动神经元数目开始明显减少，而同期对侧前角运 动神经元的减少则不明显。运动神经元的减少随时间显著增加，在伤后第 21天时，伤侧已有50％以上的运动神经元降解，伤侧运动神经元的数量为 对侧的45％。坐骨神经撕脱后，类似的运动神经元减少的情况在过去的文 献中也有报道。 2．撕脱伤组和对照组中0PN阳性的运动神经元细胞情况 利用原位杂交方法检测坐骨神经撕脱后OPNmRNA表达的时间改变。