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山西医科大学硕士学位论立 6M-1对原代培养神经元类缺血再灌注损伤的影响 摘要 脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病，对其医疗投入日益增加、但发病率、死亡率 和致残率却居高不下。新的药物和治疗手段在不断产生，但其治疗效果却不尽人意。在这 些药物中神经保护剂是研究的热点。神经保护剂的种类很多，对其神经保护效果和可能机 制的研究有着重要的理论意义和实际意义。 组织和器官的生存依赖于充足的血液供应，带来营养，带走代谢产物。任何组织的缺 血只要达到一定的时间和程度，就会引起组织细胞的损伤。所以一直以来在神经科对于脑 缺血其治疗都是在时间窗内积极溶栓，时间窗外恢复脑血供。但随着研究的深入，人们发 现，再灌注并不一定使缺血损伤的细胞得到恢复，在一定条件下反而加重了损伤，使可逆 性损伤转为不可逆性损伤。因此逐渐提出了缺血一再灌注损伤的概念，即缺血组织恢复血 液灌注后反而因起损伤加重的现象。这一现象已得到充分的实验证明和理论依据。因而在 缺血性脑卒中的治疗中，单纯恢复灌流是不够的，必须给与神经保护的药物以防止再灌注 损伤。 在再灌注损伤中，凋亡是一种重要的损伤形式。因此有效的抗凋亡治疗可以保护神经 元。但是临床上目前还没有一种明确的药物应用于神经细胞缺衄再灌注损伤后的抗凋亡治 疗。 本实验试图通过应用类缺血再灌注的方法造成原代培养神经元的损伤，模拟机体的再 灌注损伤。进一步验证神经保护药物一神经节苷脂GM．1对神经细胞的保护作用。并通过 对损伤神经细胞的凋亡检测，以期证明神经节苷脂GM一1的这种保护作用是可能通过其抗 凋亡作用实现的。为进一步在临床的应用提供有益的探索。 目的：建立原代培养神经元类缺血再灌注模型：并通过对单纯类缺血再灌注处理组 和加用神经节苷脂GM．1组的比较，观察类缺血再灌注对大鼠皮质神经元细胞损伤的影响 及神经节苷脂GM．1对受损神经细胞的保护作用。 方法：l、原代神经元的培养：取新生ld一3d的Wistar大鼠，在无菌条件下分离双 侧皮质并剥离脑膜，将脑组织剪碎后用胰酶消化，终止消化后过滤，离心，调整细胞浓度， 用O．4％的台盼蓝染色计数活细胞数，将细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基种植于 培养板或玻片上。然后置于37。C、5％C02的培养箱中培养，48h加阿糖胞昔以抑制非神 经元过度增殖，以后每三天半量换液。倒置显微镜观察神经元形态，并采用神经元特异性 烯醇化酶(NsE)鉴定。2、类缺血再灌注模型的建立：用体外培养7d的大鼠皮质神经元 细胞．随机分为正常对照组、类缺血再灌注组(缺血组)、类缺血再灌注加GM．1组(实验 组)。正常组正常条件培养，缺血组在神经元细胞正常培养7d时将实验条件换为氮气替代 h、6h、12h、 空气，同时用无血清的DMEM培养30rain，然后转入正常条件下继续培养l 山西医辩文学磺士学位论文 予缺血组相同条件造模。3、检测指标：检测①细胞存活率：在96孔培养板中加入MTT 活率；②凋亡细胞光学检测法：按凋亡细胞光学检测试剂盒说明操作，加入染色剂等，倒 置显微镜下观察细胞染色情况，其中深染的为阳性细胞。⑧流式细胞仪检测细胞凋亡率： 用胰酶消化法将贴壁细胞成为细胞悬液，调整细胞密度，加入磷脂酰结合蛋白v(Annexin V-FITC)及碘化丙啶(PI)10pI，上流式细胞仪检测。4、统计学分析：数据用均数±标准 验。P0．05为有统计学意义。 结果：通过原代神经元培养的方法，经神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定，培养 出了可供实验的原代神经元。进行类缺血再灌注处理，建立成功的实验模型。流式细胞仪 检测凋亡率显示，缺血组后一时问点的细胞凋亡率均高于前一时问点(PO．01)；进行类 缺血再灌注后，除凋亡光学染色lh组外，任一时间点的缺血组、实验组的细胞活性均低于 细胞染色无明显差别(P0．05)，而流式细胞仪检测细胞凋亡率显示实验组低于缺血组 (Po．05)；在随后的不同时问点实验组的细胞活性显著高于缺血组，凋亡率显著低于缺 血组(Po．05、P0．01)。 结论：类缺血再灌注可有效造成培养神经元的凋亡，在24h内随着