第二章蛋白质化学-蛋白质结构与功能的关系资料.pptVIP

凝胶电泳 （四）层析（色谱） 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 当流动相带着待分离蛋白质溶液经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析、分子排阻色谱等，是利用各蛋白质分子大小的不同进行分离的。 亲和层析：是吸附层析，依赖于蛋白质和其配体（ligand）之间的相互作用来实现分离的。 阳离子交换层析过程 离子交换树脂 蛋白质 高离子强度洗脱液洗 高离子强度洗脱液洗 加样 平衡液洗 收集 凝胶过滤层析过程 亲和层析过程 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离 分配层析（色谱） 根据流动相当不同可以分为气相色谱和液相色谱，液相色谱中最常用的是高压液相色谱 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC) 也称高压液相层析（high pressure liquid chromatography）。这是近二十年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，利用高压输送流动相，拥有高效固定相及高灵敏度检测器，具有气相层析的全部优点。 （五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 2、渗透压法 3、超速离心法 4、凝胶过滤法 5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质分子量的测定 1、最小分子量测定法： 蛋白质含量的测定 1、凯氏定氮法 2、双缩脲反应 3、Folin-酚试剂反应 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 * * * 蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。 疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。 PrPc α-螺旋 PrPsc β-折叠 正常 疯牛病 第六节 蛋白质的性质与分离、分析技术 一、蛋白质的性质 相对分子质量很大，一般介于10 000-1 000 000道尔顿之间，也有更大的。 测定分子量的方法很多：渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （一）蛋白质相对分子质量 （二）蛋白质的两性性质及等电点 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 各种蛋白质有特定的等电点，和它所含的氨基酸种类和数量有关。 例：含有碱性氨基酸较多，则pI偏碱（偏大） 含有酸性氨基酸较多，则pI偏酸（偏小）； 含有酸、碱氨基酸数目相近时，pI为中性偏酸，约为5.0左右。 pHpI，蛋白质带负电，体内蛋白质的pI大多为5.0左右，故生理条件下一般以负离子形式存在。 蛋白质 酸性氨基酸数 碱性氨基酸数 pI 胃蛋白酶 37 6 1.0 胰岛素 4 4 5.35 RNA酶 10 18 7.8 细胞色素c 12 25 9.8～10