自固化磷酸钙人骨松质骨颗粒作骨髓间充质干细胞载体修复家兔股骨头缺血性坏死的实验研究.pdf

中文摘要 自固化磷酸钙人工骨松质骨颗粒作骨髓间充质 干细胞载体修复家兔股骨头缺血性坏死的实验 研究 摘 要 目的：骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增技 术在实验阶段已经成熟并且在临床部分已经开始应用， 但是尚未能找到其合适的载体，不便于临床的实际应用。 为提高骨髓间充质干细胞在临床应用的疗效，实验拟比 自固化磷酸钙人工骨松质骨颗粒和自体松质骨作为载体 对实验性家兔股骨头缺血性坏死的修复作用。 方法：1．实验前准备及实验动物的分组：实验动物 提前一周饲养以适应环境及观察确定无疾病。术前一天 禁食水。24只成年新西兰大耳白兔，随机分为A、B两 组，每组12只，A组为白固化磷酸钙人工骨(Calcium Phosphate marrow stem 间充质干细胞(bone mesenchymal 移植组。两组于术后2，4，6，8周各处死3只实验动物。 2．BMSCs获取培养及复合载体：术前1周从成年新西兰 大耳白兔髂后上嵴处抽取骨髓，种植于6孔细胞培养板 内，培养液为含20％胎牛血清DMEM液，放入细胞培 养箱内培养，传代密度为l×106／cm2。第3代细胞培养至 传代密度时制成细胞悬液，A组分别浸润每个 中文摘要 24小时后手术植入实验动物股骨头钻孔处；B组则分别 浸润分成和CCPC一样大小的明胶海绵颗粒，放入细胞 培养箱内培养24小时后，手术将松质骨颗粒和载有 BMSCs的明胶海绵均匀混合并植入实验动物股骨头钻 孔处。3．实验动物模型制备及手术方法：所有动物双侧 股骨头都参加实验。取俯卧位，40mg／kg硫喷妥钠腹腔 注射麻醉。常规消毒，铺单。髋关节后侧切口，显露股 骨头，不切断圆韧带，髋关节不脱位，保护周围组织， 用液氮棉团连续冷冻股骨头3分钟造成股骨头坏死模 型。自然复温后从股骨颈内后侧向股骨头内钻孔，用直 径3．5mm钻头向股骨头内钻入4mm，到达关节软骨下。 钻孔后植入复合BMSCs的明胶海绵混合自体松质骨颗 粒，关闭伤口。4．HE染色：取出10％福尔马林中保存的 股骨头标本，从股骨颈基底锯断，将标本做标记后放入 8％甲酸溶液中换液三次，共脱钙两周。脱水、透明、浸 蜡、修块，做5pm切片，水浴，铺片，烤片。然后行 HE染色：熔蜡，酒精梯度水化，亚甲兰染色，酸化， 返兰，伊红染色，再酒精梯度脱水，透明。然后光学树 脂封片。5．X线及组织学观察：X射线观察钻孔区骨密 度及骨小梁的变化情况。苏木精．伊红染色切片，光镜观 察钻孔区细胞及骨小梁的变化情况。6．统计学方法：采 用SPSS11．5统计学软件，对缺损区新生骨小梁图像， 进行面积百分比均值的t检验分析。 结果：1．股骨头X线检查：A组2周标本，钻孔区 可见股骨头中部植入复合BMSCs的CCPC部位有明显 中文摘要 的高密度区，骨小梁结构完整。4周标本，钻孔区高密 度部分密度略减，钻孔区以外密度有所增加，骨小梁结 构完整。6周标本，内植CCPC部分密度仍略高，出现 骨小梁，钻孔区界限模糊，钻孔缺损区以外密度有所增 加，骨小梁紊乱，8周标本，内植CCPC部分密度基本 正常，出现骨小梁，钻孔区界限进一步模糊。钻孔缺损 区以外密度有所增加，骨小梁紊乱，出现软骨下囊性变。 B组2周标本钻孔区密度减低，钻孔区以外密度有所增 加，骨小梁结构完整。4周标本，钻孔区密度增高但仍 低于正常，钻孔区以外密度有所增加，骨小梁结构完整。 6周标本，钻孔区可见稀疏骨小梁，钻孔区以外密度增 加，骨小梁紊乱，出现软骨下囊性变。8周标本，钻孔 区密度基本正常，出现骨小梁，钻孔区界限模糊。钻孔 区以外密度有所增加，骨小梁紊乱，出现软骨下囊性变。 从总体上看，A组缺损区因植入完整的CCPC，故密度 逐渐降低最后出现正常骨小梁结构。B组缺损区植入明 胶海绵混合白体松质骨颗粒，密度由开始降低后升高， 最后出现正常骨小梁结构。2．股骨头的组织检查：A组 术后2周时，钻孔缺损区内有大量的成骨细胞，缺损区 边缘有较多的类骨质和新生骨小梁。4周时缺损区内有 大量骨小梁形成及类骨质填充。6周时缺损区内可见比 较成熟的骨小梁，并出现骨髓组织。在8周时缺损区内