宫内移植raa-bdnf对抑制胚胎期显性脊柱裂胎鼠神经细胞凋亡的实验性研究.pdf

·中文论著摘要· 宫内移植rAAV-BDNF对抑制胚胎期显性脊柱裂胎鼠 神经细胞凋亡的实验性研究 目 的 柱裂、露脑畸形，颅裂，脑积水等，其中以脊椎裂最为常见，约占全部畸形的95％ 左右。目前认为神经管畸形的发生是遗传和环境因素共同作用的结果。在胚胎发 育过程中细胞凋亡现象普遍存在，这对于多细胞生物的组织形成和形体构建具有 重要意义。细胞凋亡和增殖贯穿于胚胎发育过程中的整个阶段，并且是由一系列 相关基因所控制的。任何原因导致的凋亡失衡都能干扰整个机体器官的正常发育 及其形态的构成。许多资料显示NTDs与细胞凋亡有关。脑源性神经营养因子 (Brainderived factor，BDNF)是神经营养因子家族成员之一，它是 neurotrophic 由靶细胞合成并分泌，经神经突起逆行转运至神经元胞体并且主要与其高亲和力 受体酪氨酸激酶B(TrkB)结合而发挥神经保护作用，并可维持胚胎发育中神经 元的存活、促进其分化与增殖，诱导其轴突生长以及调控成熟神经元的生理功能 和促进损伤神经元的修复。基因治疗作为一种全新的治疗疾病的方式兴起于20世 纪80年代，其具体操作是通过基因载体将有治疗作用的基因导入靶细胞，使其过 表达目的蛋白，从而纠正由于先天基因缺陷而导致的蛋白分泌不足，从而达到治 愈疾病的目的。因此我们利用基因疗法将带有BDNF基因的重组腺相关病毒载体 (Recombinantadeno．associated virus，rAAV)转染到先天性显性脊椎裂胎鼠体内 进行治疗，观察rAAV介导的BDNF对先天性脊椎裂中神经细胞凋亡的抑制作用， 为先天性脊椎裂治疗提供新思路。 方法 1、雌雄Wistar大鼠按5：l合笼，次日晨阴道涂片，发现精子者视为孕0天 (E0)。 2、Wistar大鼠在EIO给维甲酸制作动物模型：将维甲酸溶于橄榄油中 (40mg／m1)，以剂量为150mg／ml经胃管注入胃内给药。 照组。治疗组和对照组均在大鼠E16利用胎仔外科的方法利用微量注射器在手术 显微镜下将带有目的基因和不带目的基因的病毒载体分别注射到显性脊柱裂胎鼠 腰骶部。正常对照组为未给药致畸组，其不做任何处理。 4、于E20无菌条件下打开孕鼠子宫，治疗组和对照组分别找到转基因治疗的 胎鼠：正常对照组随机取活胎即可。将取出的胎鼠直视下心内灌注4％多聚甲醛 进行固定，待胎鼠组织固定好后于胎鼠上肢水平截断脊髓置于4％多聚甲醛中继 续浸泡固定24小时。然后置于20％蔗糖溶液中脱水24小时，之后将标本取出置 于．80℃。 5、冰冻切片后利用TUNEL试剂盒检测三组细胞凋亡情况；免疫荧光观察三 组BDNF的表达情况。 结 果 疗组和空载体治疗组各9只孕鼠，其中治疗组转染胎鼠30只，得到显性脊柱裂脊 萌21个，胎鼠的存活率为70．00％，得到病毒载体成功转染神经组织的显性脊柱 裂脊髓9个；空载体治疗组转染胎鼠28只，得到显性脊柱裂脊髓20个，胎鼠的 存活率为71．43％，得到病毒载体成功转染神经组织的显性脊柱裂脊髓9个，两组 比较经卡方检验，P0．05，差异无统计学意义。说明带有目的基因的病毒载体 和不带目的基因的病毒载体对胎鼠的成活率无明显影响。正常对照组为10只孕 鼠，随机取胎鼠为10只，得到正常胎鼠脊髓10个。 2、本实验利用免疫荧光法对治疗组、空载体治疗组及正常组进行染色测定 BDNF的表达，结果可见治疗组红色荧光的强度明显较空载体治疗组和正常组 强。 3、本实验利用TUNEL染色试剂盒对大鼠脊髓切片进行染色，测定其凋亡细胞 数量，通过激光共聚焦显微镜成像比较可见治疗组的凋亡情况明显较空载体治疗 组和正常组减轻。治疗组平均每个脊髓切片的凋亡细胞数为5士3个，空载体治疗 2 组平均每个截面的凋亡细胞数为20-a：6个，正常对照组每个截面的凋亡细胞数为 114-6个。经t检验，治疗组和空载体治疗组P0．05；治疗组和正常组P0．05； 空载体治疗组和正常组P0．05；各组之间的差别有统计学意义。说明BDNF转 基因治疗的方法能够显著减轻先天性显性脊柱裂神经细胞凋亡的情况。