胶原-壳聚糖支对脂肪间充质干细胞和软骨细胞共培养的研究.pdf

目 录 中文摘要………………………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………………………4 研究论文胶原．壳聚糖支架对脂肪间充质干细胞和软骨细胞共培养的 研究 ， 前言………………………………………………………………………9日U舌……………………………………………………………………… 材料与方法……………………………………………………………．．10 结果……………………………………………………………………．．16 附图……………………………………………………………………．．19 附表……………………………………………………………………．33 讨论……………………………………………………………………36 结论……………………………………………………………………．40 参考文献…………………………………………………………………4l 综述壳聚糖／胶原生物材料支架在骨组织工程中的应用………………45 致谢…………………………………………………………………………．．51 个人简历……………………………………………………………………．．52 中文摘要 胶原．壳聚糖支架对脂肪间充质干细胞 和软骨细胞共培养的研究 摘 要 目的：探讨一种适合脂肪间充质干细胞和软骨细胞生长、增殖，并 能增强共培养诱导作用的三维立体支架，为扩大和优化软骨组织工程种子 细胞提供实验依据，为临床关节软骨损伤修复寻找新载体。 方法： 1胶原．壳聚糖支架的制造 将质量分数2％的胶原与质量分数3％的壳聚糖混合，溶于1％的乙 取出支架切成高5mm的圆柱体，中和支架内的醋酸，PBS液反复冲洗， 至PH值中性，酒精浸泡，紫外照射后，无菌条件下冷冻干燥24h，制备 得胶原．壳聚糖多孔支架。 2脂肪间充质干细胞的提取和鉴定 I 新西兰大白兔，无菌条件下取双侧腹股沟脂肪，剪碎，加入到lg／L 型胶原酶，37。C震荡消化30min，离心、收集细胞，接种于培养瓶中。鉴 兔抗大鼠多克隆抗体，次日弃去一抗，加入山羊抗兔FITC标记的二抗， 室温孵育2h后弃去二抗，PBS清洗，荧光显微镜下观察并照相。 3软骨细胞的提取与培养 成年新西兰大白兔，常规备皮，消毒，取膝关节股骨髁、胫骨平台软 30min，中止消化后，加入II型胶原酶，37℃水浴振荡消化，分阶段收集 细胞，加入高糖的DMEM，倒置显微镜下观察，根据细胞数量多少，分 别移入不同大小的细胞培养瓶。 4细胞种植 脂肪干细胞和软骨细胞分别传代培育至第三代，取脂肪间充质干细 胶原．壳聚糖支架、壳聚糖支架和无支架细胞培养板上。 中文摘要 5电镜检测 观察支架的孔径及细胞在支架上的生长情况。通过称量支架吸水前 后的重量，计算孔隙率和吸水性。 6 MTT法检钡9 一、共培养细胞在不同支架上的增殖活力。二、在相同胶原壳聚糖支 架上，不同细胞的增殖情况。 7细胞爬片甲苯胺蓝染色检测 把不同支架环境下共培养细胞消化下来，爬片培养，染色观察各组的 糖胺聚糖分泌情况。 8PCR检测 根据不同支架和不同细胞分九组，检测各组细胞的糖胺聚糖和II型 胶原RNA表达水平，以区别在胶原．壳聚糖支架下共培养的效果。 9实验分组 根据实验设计需要，MTT检测分两组，即共培养细胞接种到3种不 同支架上为一组，在同一种胶原．壳聚糖支架上接种不同细胞为二组。免 疫组织化学染色检测分3组，即共培养细胞接种到3种不同支架上。 RT-PCR检测共分9组，实验组3组(即共培养细胞接种到3种不同支架)， 基础对照3组(即相同数量软骨细胞接种到3种不同支架)，空白对照3 组(即相同数量脂肪间充质干细胞接种到3种不同支架)。其中所有分组 中软骨细胞接种密度、体积分数均为同一标准，即各组