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以羊膜为载体培养口腔粘膜上皮在眼表重建中的应用 中文摘要 以羊膜为载体培养口腔粘膜上皮 在眼表重建中的应用 眼科学 2003级硕士研究生王玉娟 指导老师 黄挺副教授 摘 要 角膜缘干细胞位于角膜缘基底层，是角膜上皮细胞分化和增殖的来源。眼部 化学伤、热烧伤、Stevens—Johnson综合征(Stevens—Johnsonsyndrome，SJS)等多 stemcell 种病因可引起角膜缘干细胞缺乏(1imbal 角膜结膜化、新生血管、基质瘢痕化等为特征，最终导致角膜混浊、溃疡、穿孔， surface 甚至视力丧失。对于此类由角膜缘干细胞缺乏导致的严重眼表疾病(ocular surface disease，OSD)，眼表重建(ocular 常规手术方法疗效欠佳。结膜移植术后出现大量角膜基质新生血管，且结膜组织 透明度低，影响患者视力及外观。羊膜移植术后眼表上皮为结膜表型，且对于严 重干眼、弥漫性上皮角化和角膜缘缺血等患者疗效甚微。自体角膜上皮移植(角 膜上皮移植术和角膜缘移植术)仅能治疗单眼发病患者，异体角膜缘干细胞移植 术后存在排斥反应，影响植片长期存活。随着生物工程及再生医学的发展，人们 尝试使用体外培养非角膜上皮来源的复层非角化上皮细胞移植片自体移植进行 眼表重建。本课题目的在于制备兔角膜缘干细胞衰竭模型，观察以脱细胞羊膜为 载体体外培养的人|=：1腔粘膜I=_-皮移植片用于眼表重建的疗效及可行性，为人口腔 粘膜白体移植提供理沦和实验依据。 第一章：目的l探索体外培养人口腔粘膜上皮细胞的方法。2．体外培养人 口腔粘膜上皮细胞的鉴定。方法取供体口腔颊部粘膜卜皮组织制备成单细胞悬 以羊膜为载体培养口腔料膜上皮在眼表重建中的应用 中文摘要 液，以脱细胞羊膜为载{奉、3T3成纤维细胞为饲养层，采用气一液相培养方法构 建移植片。培养后期对El腔粘膜上皮细胞移植片进行形态学观察及免疫组化染色 以鉴定移植片上皮细胞的表型。结果以羊膜为载体体外培养的人口腔粘膜上皮 细胞为排列整齐的复层上皮，细胞结构完整，组织学上类似正常人角膜上皮。免 疫组化结果显示，正常及体外培养的人口腔粘膜上皮均表达角蛋白K3、K4、K13， 角蛋白K10表达阴性。结论1人口腔粘膜上皮为复层非角化上皮细胞，生物学 特性与正常人角膜上皮相似，且分化程度低、更新周期短，可作为角膜上皮移植 替代物。2脱细胞羊膜结构稳定、抗原性低，可作为体外培养人口腔粘膜上皮 细胞的良好载体。3采用3T3成纤维细胞为饲养层，气一液相体外培养人口腔 粘膜上皮，细胞复层排列整齐，可分化为角膜样上皮细胞。4体外培养的人|1 腔粘膜上皮细胞与脱细胞羊膜贴附紧密，构建的口腔粘膜上皮移植片结构稳定。 第二章：目的1探讨使用体外培养人口腔粘膜上皮移植重建眼表的方法。 2评价体外培养口腔粘膜上皮移植在眼表重建中的价值。方法采用叫；形板层切 除法制备单眼兔角膜缘T细胞衰竭模型，3—4周后行口腔粘膜上皮片移植术重 建眼表。术中刮除兔角膜面增生的结膜化组织及新生血管膜，将体外构建的人口 腔粘膜上皮移植片平铺J：角膜创面，角膜缘处缝线问断缝合。术后每日行裂隙灯 检查，观察移植片的存活状况及眼表的稳定性。，术后1月取兔角膜组织进行组织 学切片和免疫组化染色明确上皮来源。结果制备角膜缘干细胞衰竭模型术后，1 只兔因术眼感染自然死亡；余9只兔术眼出现角膜结膜化、新生血管及角膜混浊 等角膜缘干细胞缺乏表现。7只兔行眼表重建术后，6只兔植片存活情况良好，l ％荧光素钠染色阴性，角膜透明度较术前不同程度提高，移植片下方见新生血管 增殖，局限于角膜周边区；1只白兔因术后3天羊膜脱落更换移植片，二次术后 植片存活良好，角膜透明程度提高。术后1月角膜HE染色见复层上皮细胞排列 紧密，免疫组化结果角蛋白K3、K4、K13表达阳性。结论1体外培养