多重聚合酶链反对真菌性角膜炎快速诊断及菌属鉴定的探索.pdf

【 多重聚合酶链反应对真菌性角膜炎快速诊断 及菌属鉴定的探索 研究生 杨子建 导师 王丽娅 郑州大学 河南郑州450052 摘要 真菌性角膜炎是严重的致盲性眼病之一，近年来发病率呈逐年上升趋势。早 期确诊是有效降低致盲及致残率，制定合适治疗方案的关键。目前临床上常用的 确诊方法是刮片镜检和真菌培养法，但是不能进行菌种鉴定和需时较长是它们的 不足之处。 我们通过探索构建了一个多重PCR体系，可以对真菌性角膜炎进行快速诊断 同时对菌属进行鉴定。并通过对比传统的诊断方法，评价PCR体系诊断真菌性角 膜炎的有效性。 目的：应用多重PcR快速诊断真菌性角膜炎并同时鉴定菌属。 方：．去： (1)通过设计属特异性引物，建立一个多重PcR体系对真菌性角膜炎 常见的九种致病菌腐皮镰孢菌，禾谷镰孢菌，木贼镰孢菌，串珠镰孢菌，烟睦霉 菌，黄曲霉菌，黑曲霉菌，新月弯孢菌，牵连青霉菌的DNA进行检测，并观察 该体系对人类基因组及其他眼部常见致病微生物DNA的检测结果。(2)采用 腐皮镰孢菌标准菌株提取的质粒DNA稀释液梯度对多重PcR体系进行优化，选 择合适的各组分用量和循环参数。 (3)紫外分光光度仪测定质粒DNA的质量 浓度，根据测定值将质粒DNA进行系列稀释，检测反应体系的灵敏度。(4) 42例临床培养真菌和86例临床角膜刮片标本用多重PcR体系鉴定，以验证本 郑州大学2006届硕士研究生论文 多重PcR对真菌性角膜炎快速诊断及菌属鉴定的探索(摘要) 体系的可靠性。 结果：经过多重PcR体系扩增后，琼脂糖凝胶电泳结果镰孢菌属、曲霉菌属、 的条带。人基因组DNA及其他眼部常见的致病微生物DNA则未扩增出条带。 表明本体系具有高度的特异性。 PCR灵敏度研究中，镰孢菌、曲霉菌、青霉菌、弯孢菌质粒DNA 1ng一10fg 的6个质量浓度的模板加入反应体系中进行扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下 观察，结果显示10喀的DNA浓度扩增出了目的条带而1fg的DNA浓度为阴性 因此，该多重PCR体系的灵敏度为10fg。 42例临床培养真菌用多重PCR体系鉴定，其中包括镰孢菌28例，曲霉菌 11例，青霉菌2例，弯孢菌1例。鉴定结果镰孢菌，曲霉菌及弯孢菌和培养结 果一致，2株青霉菌中1例鉴定结果与培养结果一致而1例未能扩增出目的条带。 结果表明本多重PcR体系具有高度的特异性。 临床标本检测：86例临床角膜刮片标本，分别用KOH涂片法、多重PCR 体系和真菌培养法鉴定。KoH涂片法检测阳性46例，阳性率为53．5％；多重PCR 法检测阳性60例，阳性率为69．8％；真菌培养法阳性59例，阳性率为68．6％。 经x2检验，真菌培养法及多重PcR法的阳性率与KOH涂片法阳性率的差别有 统计学意义(PO．05)而真菌培养和多重PcR法的阳性率的差别没有统计学意 义(PO．05)。 结论：多重PcR体系可对临床常见致病真菌快速诊断并鉴定到菌属，方法快 速，敏感，特异。 关键词： 真菌；角膜；聚合酶链式反应 郑州大学2006届硕士研究生论文 多重PcR对真菌性角膜炎快速诊断及菌属鉴定的探索(摘要) offast and identi6ed study diagnosisspecies Exper