大肠埃希菌耐药及其耐氟喹诺酮机制研究.pdfVIP

大肠埃希菌耐药性及其耐氟喹诺酮机制研究 摘 要 目的：了解本地区大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的耐药发生率，耐 药分布情况，及对氟喹诺酮类药物耐药机制的探讨。方法：1．纸片扩散法 NationalCommitteeforC1inical Laboratory 的该方法测定100株大肠埃希菌对14种抗菌药物的耐药性并初步筛选出耐 环丙沙星菌株。该实验方法要点：将待测细菌制备成与0．5麦氏标准管浊 燥数分钟，用无菌镊将含有氨苄西林、萘啶酸、哌拉鹾林、庆大霉素、环 丙沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、加替沙星、头孢呋辛、头孢噻肟、阿米 卡星、氨曲南、头孢吡肟、亚胺培南等药物的纸片分别平贴于M—H培养基 表面，每张纸片间距离不少于24mm，纸片中心距离平皿边缘不少于15mm。 将贴有药片的平皿置于35。C孵箱，孵育18h后，用毫米尺测量抑菌环直径， 抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，抑菌环直径的大小反映了 测试细菌对测定药物的敏感程度。标准参照2004年NCCLS标准，每次试验 株耐环丙沙星的大肠埃希菌对环丙沙星和左氧氟沙星的最低抑菌浓度 (MIC)。将环丙沙星和左氧氟沙星标准品按照公式准确计算、称量并溶于 u 三蒸水中，配制成浓度为1280g／ml的储备液，并分装于干燥灭菌小瓶中， 于一20℃保存备用。制各测试菌液和质控标准菌菌液，使其含量达到 107CFU／ml。用肉汤把抗菌药物进行对倍稀释，每个试管中的抗菌药物终浓 p p u 度依次为：128g／ml、64 H p g／ml、32g／ml、16肚g／ml、8g／ml、4 g／ml、 2u u u u g／m1、1g／ml、0．5g／ml、0．25 g／ml、0．125”g／ml、0．06Ⅱg／ml、 0．03强g／ml，簏微量蕊样器取0．iml菠液依次由低浓度劐高浓度进孝亍撩稀， 按种后将其置予35℃孵箱，孵育24h压，以细菌不出现爨眼可见生妖嬲最 低药物浓度为该药物对测试细菌的MICs。标准参照2004年NCCLS标准， 每次试验均用大肠埃希菌标准菌株ATCC25922进行质控。3．错配PCR技术： mutation 又名错配扩增突变分析(mismatchamplification assay，MAMA)， 分析检测耐环丙沙星的大肠埃希菌gyrA基因和parC基因突变。基本原理 的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可通 过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。简要过程：把待检 5 u 分钟，去弃上清液，加入500l无菌去离子水，95℃加热10分钟，再离 5分钟，去其上清液作为DNA模板；在0．2mlPCR反应管中依 心13000rpm 3 buffer5ul、25mmol／Lul、lOmmol／LdNTPlpl、 次力口入lO×PCR MgCL2 l u u l、 5U／u l、上游引物0．35l、基因检测引物0．25|l TaqDNA聚合酶O．3