大蒜素与顺铂单联合应用对宫颈癌hela细胞裸鼠移植瘤生长及hpv18-e6基因表达影响的研究.pdf

中 文 摘 要 大蒜素与顺铂单独及联合应用对宫颐癌Hela细胞 裸鼠移植摘生长及HPV18-E6基因表达影晌的研究 摘 要 目的:宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一。据统计， 2000年全球宫颈癌新发病例47万，死亡病例23万，现患 病例140万。目前认为人乳头瘤病毒 (HPV)感染是宫颈癌 的主要致病原因。早期宫颈癌不论手术还是放疗，疗效均满 意，但中晚期宫颈癌治疗效果差，因此寻找合理的综合治疗 方法是一个迫切需要解决的问题。顺铂作为治疗肿瘤的首选 化疗药物，对于宫颈癌的疗效是肯定的。但作为化疗药物如 果长期大量的应用，药物在作用于肿瘤的同时还会引起严重 的副反应，而且可导致肿瘤对化疗药物产生耐药反应。因此， 寻找一些毒性小、副反应少且有一定疗效的天然药物治疗肿 瘤，或者利用它们增加化疗药物的敏感性就显得极其重要。 大蒜素是具有多种生物活性的化合物，近年来，动物实验和 体外研究均已证实了大蒜素中的活性物质具有抗癌作用。本 实验室前期的研究发现:大蒜素对化疗药物有增敏作用，而 且大蒜素能抑制人宫颈癌Hela细胞中的HPV18病毒基因序 列中的癌基因E6的表达。本研究在实验室前期研究的基础 上，探讨了大蒜素与顺铂单独及联合应用对人宫颈癌Hela 细胞裸鼠移植瘤生长的影响，并且观察这两种药物是否能对 整合入Hela细胞中的HPV18病毒基因序列中的癌基因E6 的表达产生影响，以期对临床上药物治疗与预防宫颈癌寻找 更加完善的途径。 中 文 摘 要 方法 1细胞培养:常规方法复苏冻存于液氮罐中的宫颈癌 Hela细胞，接种于含 10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中 培养，置于 370C,5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养，密 切观察细胞生长情况，待细胞生长至70%融合时(约2-3天) EDTA消化传代。 2接种裸鼠:BALB/c-nu裸鼠30只，4-6周龄，18- 22g，雌性，于河北医科大学动物中心适应性生长3天后， 取对数生长期的人宫颈癌Hela细胞，用EDTA消化后配制 成2X10/ml单细胞悬液，在无菌条件下于裸鼠背侧近右后 肢处皮下接种0.2ml/只。接种后14天可见肿瘤生长，肿瘤呈 菜花状，色红、质硬，表面不平，可活动。 3体内裸鼠移植瘤实验:肿瘤细胞植入皮下后第15天， 将裸鼠称重后用随机数字表法分成四大组，6小组，每小组 5只，进行尾静脉注射，隔日一次，共7次。药物浓度及具 体分组如下:(1)对照组;0.2ml生理盐水;(2)顺铂组:0.2ml 浓度为5mg/kg的顺铂;(3)大蒜素组:0.2ml浓度为25mg/kg 大蒜素:(4)大蒜素与顺铂联合组:又分为①顺铂+大蒜素低 浓度组:0.2m1浓度为5m叭g的顺铂++10mg/kg大蒜素:② 顺铂十大蒜素中浓度组:0.2ml浓度为5mg/kg的顺铂++25m叭g 大蒜素;③顺铂+大蒜素高浓度组:0.2ml浓度为5m叭g的 顺铂+40mg/kg大蒜素。 4肿瘤生长监测:分别于接种第14天 (用药前)、接种 第21天及接种第28天 (停药后)测量肿瘤大小，于用药前 后测量裸鼠体重。用游标卡尺测量瘤体最长径(a)与最短径 (b)，肿瘤的体积为V(mm)=nabz/6，描绘移植瘤生长曲 一 .- .一 .一 .一 .一 一 .一 一 ，~~~~~~~~ ‘~..几 ‘，.，~~~~~~ ‘‘曰，，， ..，.，叫，~，~ ‘~ ‘‘.一 一 z 中 文 摘 要 线图。 5抑瘤率检测:停药次口终_IF.观察，采用摘眼球法处死 裸鼠，剥出瘤块，用电子天平称量瘤重(W)，计一算抑瘤率= (对照组W一实验组W)/对照组WX100%. 6病理组织学检查:处死裸鼠后，取部分瘤组织及肝脏、 肾脏，用 10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色后在光镜下进行组织学观察。 7电镜观察凋亡细胞超微结构:处死裸鼠，在血供停止 30秒内取部分瘤组织，体积为1mm3，用4%戊二醛固定， 按常规方法洗涤、脱水、包埋、切片，柠檬酸铅染色液