应用elispt技术检测结核菌感染的研究.pdfVIP

中文摘要 应用ELISPOT技术检测结核菌感染的研究 摘 要 Linked． 目的：建立应用酶联免疫斑点(Enzyme immunospot Assay，ELISPOT)技术检测结核菌感染的方法， 初步研制酶联免疫斑点试剂盒(简称自制试剂盒)，并评价 其在结核病诊断临床中的应用价值。 方法：选择30例非结核感染志愿者，26例结核病人和 4例结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验强阳性、无任 何结核病临床症状且相关检查结果无异常的志愿者，用英国 Oxford Immunotec公司研制的TSPOT-TB试剂盒(简称T SPOT-TB试剂盒)检验。 根据结核杆菌特异的效应T淋巴细胞在特异抗原的刺激 存在对结核杆菌反应的效应T淋巴细胞的原理，建立应用 抗体包被96孔硝酸纤维素膜板，用密度．梯度离心法分离被 检测者外周血单核细胞，加入96孔板中，用特异性重组 核杆菌特异的效应T淋巴细胞将分泌IFN-3，然后加入生物 素标记的IFN-7多克隆抗体作为检测抗体，再加入碱性磷酸 酶(AKP)标记的链亲和素，加入底物BCIP／NBT溶液显色， 在板底形成肉眼可见的深蓝色斑点。每一个斑点代表一个分 泌IFN-y的T淋巴细胞。根据体内是否存在结核杆菌效应T 淋巴细胞，对结核杆菌感染进行辅助诊断。 中文摘要 改变不同的实验条件确定应用ELISPOT技术检测结核 杆菌感染方法的最佳细胞浓度、孵育时间，蛋白浓度等，初 步研制自制ELISPOT试剂盒。选择32例非结核感染志愿者 和31例结核病人，均使用TSPOT-TB试剂盒和自制试剂盒 进行检验。将两者检测结果进行对比。 结果：用TSPOT-TB试剂盒进行检验，30例结核感染 (1／30)阳性。 改变不同的实验条件来确定自制试剂盒的各个合适的 实验条件，结果表明：2X105细胞密度较为合适，孵育时间 20h为实验条件，刺激结核致敏T淋巴细胞的蛋白浓度20“ ∥ml为实验条件。 ． 用TSPOT-TB试剂盒和自制试剂盒对32例非结核感染 SPOT-TB 者和31例结核病人进行检测，结果92．1％(58／63)T 试剂盒与自制试剂盒检测结果相同，7．9％(5／63)结果不同。 对两种试剂盒检出结果行X2检验，两者差异无显著性(P 0．05)，说明两种试剂盒对血样阳性检出率没有显著性差异。 T 31例已确诊结核病人检测结果为tSPOT-TB试剂盒87．1％ 结核感染者检测结果为：T 阳性，自制试剂盒25．O％(8／32)阳性。自制试剂盒的敏感 性略高于TSPOT-TB试剂盒。自制试剂盒的假阳性率高于后 者，但因所选病历中包括消化系统和血液肿瘤患者，以及老 年人等免疫低下者，不排除其为结核潜伏感染者，因机体免 疫力低下，对PPD实验无反应。故尚需进一步的追踪阳性病 中文摘要 例是否发病。自制试剂盒痰菌阳性组检测孔内斑点数显著高 于痰菌阴性组检测孔(P0．05)，说明痰菌阳性患者体内特 异性IFN-Y分泌细胞数有不同程度提高。 SPOT-TB 结论：英国OxfordImmunotec公司研制的T 试剂盒诊断结核病感染者的敏感度和特异性均较高；本研究 建立了一种结核病细胞免疫诊断试剂盒，其诊断结核病感染 者的敏感性和特异性与TSPOT-TB试剂盒相似，且操作简 便，花费小；ELISPOT在检测结核潜伏感染者敏感性和特异 性均高于PPD皮肤试验。 关键词：结核；诊断；Y．干扰素；酶联免疫斑点法 (ELISPOT) ． 英文摘要 on infectionof Stud