第章基因工程要点.ppt

3 其它类型基因组的基因组成 质粒基因组基因：有的具少量单独存在的结构基因 病毒基因组基因：有的含有内含子 线粒体基因组基因：不含SD序列，有些具内含子 叶绿体基因组基因：有些不含SD序列，有些具内含子 二 目的基因的来源 目的基因来源于各种生物，包括人类、动植物和微生物 三 分离目的基因的途径 酶切直接分离 PCR扩增法 化学合成法 构建基因组文库或cDNA文库分离法 1.利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因 BamHI EcoRI Pst I 目的基因 ori EcoRI+BamHI 双酶切 BamHI EcoRI 目的基因 2.利用PCR直接扩增目的基因 目的基因 已知序列 已知序列 PCR扩增 含目的基因的DNA片段 引物1 引物2 3. 目的基因的化学合成 4.通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因 （1）.基因组文库 定义：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个受体菌群即为该种生物的基因组文库 构建基因组文库的示意图 （2）.cDNA文库 定义：某生物基因组转录的mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中。这样的群体称为该生物的cDNA文库。 构建cDNA文库示意图 （3）.从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因 1) 根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选分离 在培养基上培养菌落 转膜 把菌落吸印在膜上 裂解 菌落的DNA裸露出来 探针杂交 找出阳性克隆 核酸探针：即是指一段用放射性核素或其他标记物（如荧光素等）标记的与目的基因互补的DNA或RNA。 2) 根据目的基因特异性表达进行分离 菌落转膜 菌落转膜 含目的基因菌落 小麦白粉病菌诱导表达cDNA文库 小麦的普通cDNA文库 小麦总mRNA探针 杂交 杂交 隐性反应克隆子 第五节 目的基因导入受体细胞 质粒载体 ＋ (水稻基因B) 工具酶 重组DNA分子 受体细胞（动植物或微生物细胞） 导入 大量扩增或有效表达 一 受体细胞 受体细胞：能摄取外源DNA并稳定遗传的细胞。 原核生物细胞、动物细胞、植物细胞及真菌细胞 原核生物 构建基因组文库的受体菌 构建cDNA文库的受体菌 生产某种目的基因产物的工程菌 克隆载体的受体菌 原核生物细胞是基因工程中最常用的受体细胞之一 原核生物细胞在表达真核生物基因方面存在一定缺陷 真菌细胞－－酵母是外源真核基因理想的表达系统 植物细胞－－具有遗传全能性，容易获得转基因个体 动物细胞－－体细胞核遗传全能性发现后发展迅速 二 重组DNA分子导入受体细胞 载体系统 选择导入方法 受体细胞 1.外源DNA转化法 转化：使外源DNA分子进入受体细胞，并在其中 稳定维持和表达的过程。 感受态细胞：处于能摄取外源DNA分子生理状态 的细胞 感受态细胞制备：用二价阳离子（如Mg2＋、Ca2+、Mn2+）处理 感受态细胞转化法常用于微生物； DNA-磷酸钙共沉淀法可用于动物细胞转化； 多聚物(PEG)介导可用于原核生物细胞、动物细胞及植物原生质体的基因转化。 2.根癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 叶盘转化法: 原生质体共培养法: 悬浮细胞共培养法: 含Ti质粒的农杆菌 植物细胞 T-DNA整合到植物基因组中 不足：仅限于双子叶植物 共培养 (3) 微弹轰击转化法（基因枪法） 将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，使DNA吸附在金属颗粒的表面，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中。 2. 病毒（噬菌体）颗粒转导法 转导：通过噬菌体或病毒颗粒感染，把重组DNA导入被感染的受体细胞的过程。 转导 三 克隆子筛选 克隆子：指摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞，也称转化子。 1. 根据载体选择标记基因筛选转化子 (1). 根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子 筛选大肠杆菌转化子的部分抗生素抗性基因和相应的选择药物 新霉素磷酸转移酶基因(nptII)：新霉素、卡那霉素、庆大霉素、G418 氯霉素酰基转移酶基因(cat)：氯霉素 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)：潮霉素 动物 植物 (2). 根据载体除草剂抗性基因和相应选择药物筛选转化子 (1). 根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子